Графическое представление уравнения Михаэлиса-Ментен

Кинетика ферментативных процессов (продолжение)

Результаты измерений начальных скоростей при различных концентрациях субстрата удобнее всего представлять графически, с тем, чтобы можно было оценить значения кинетических параметров и точность эксперимента. Самый простой способ графического представления данных, описываемых уравнением (1.9):

υ_m ∙ [S]

υ_О = ————. (1.9)

K_m + [S]

Он состоит в построении графика зависимости υ_О от концентрации субстрата [S].

Для практических целей этот график оказывается наименее пригодным. Обусловлено это следующим:

- трудно построить равнобочные гиперболы;

- определенные трудности возникают при построении касательных к кривой – их всегда хочется провести как можно ближе к ней;

- трудно проводить сопоставление гипербол между собой.

Рис. 1.3.Определение параметров υ и K_m методом Михаэлиса и Ментен.

Михаэлис и Ментен строили график зависимости υ – lg([S]/K_m) следующим образом (рис. 1.3.). Дифференцирование уравнения (1.9) показывает, что

dυ_О K_m ∙ υ_m ∙ [S]

——— = ————————, (1.20)

d ln [S] (K_m + [S])²

или

dυ_О 2,303 ∙ K_m ∙ υ_m ∙ [S]

——— = ————————. (1.21)

d lg [S] (K_m + [S])²

Максимальный наклон имеет место при [S] = K_m; он равен 2,303 ∙ υ_m / 4, то есть 0,576 υ_m. Следовательно, υ_m можно рассчитать, разделив значение максимального наклона на 0,576. Михаэлис и Ментен определяли затем константу K_m как значение [S], при котором скорость составляет половину υ_m.

После опубликования работы Лайнуивера и Бэрка большинство исследователей на практике стали использовать уравнение Михаэлиса – Ментен в форме, позволяющей представить результаты кинетических исследований в виде прямой линии. Линеаризацию можно проводить тремя способами:

[S] K_m [S]

—— = ——— + ——, (1.22)

υ_O υ_m υ_m

K_m ∙ υ_O

υ_О = υ_m − ————, (1.23)

[S]

1 1 K_m

—— = —— + ————. (1.24)

υ_O υ_m υ_m ∙ [S]

В первом случае (1.22) зависимость [S] / υ_O от [S] графически изображается прямой с наклоном 1/ υ_m и отсекает на осях [S] / υ_O и [S] отрезки K_m / υ_m и − K_m соответственно (рис. 1.4.). Аналогичным образом, откладывая υ_O от υ_O / [S] и 1 / υ_O от 1 / [S], строят линейные графики зависимостей (1.23) и (1.24). Последние два графика изображены на рисунках 1.5 и 1.6 соответственно.

Рис. 1.4.График зависимости [S] / υ_О от [S].

Наиболее часто применяется график двойных обратных координат (1 / υ_O и 1 / [S]) Лайнуивера – Бэрка (рис. 1.6.), но он является наименее точным, чем два предыдущих (рис.1.4. и 1.5.). На всех трех графиках понятие наклона прямой подразумевает тангенс угла, образуемого ей с осью абсцисс.

Рис. 1.5.График зависимости υ_О от υ_О / [S] (график Эди - Хофсти).

Рис. 1.6.График зависимости 1 / υ_O от 1 / [S] (график Лайнуивера - Бэрка), или график двойных обратных координат.

Все три приведенные графика (рис. 1.4. – 1.6.) имеют свои недостатки и неточности, однако, имеет смысл использовать наиболее привычный график – график двойных обратных координат Лайнуивера - Бэрка.

Каков смысл величин υ_m и K_m? Смысл максимальной скорости очевиден как теоретически, так и практически. Она представляет собой максимально достижимую скорость, то есть ту скорость, с которой протекает реакция, если весь фермент находится в составе фермент-субстратного комплекса. Кинетическая постоянная k₂ в уравнении υ_m = k₂ ∙ [E]_O называется числом оборотов фермента. Число оборотов – это количество молекул субстрата, превращаемых в продукт реакции (Р) в условиях, когда весь фермент находится в составе фермент-субстратного комплекса. Например, число оборотов фермента карбоангидразы очень велико, около 6 ∙ 10⁵ с⁻¹. Таким образом, количество фермента, равное 10⁻⁶ моль, способно катализировать образование 0,6 моль Н₂СО₃ из углекислого газа и воды в 1 с, то есть

υ_m = 6 ∙ 10⁵ с⁻¹ ∙ 10⁻⁶ моль = 0,6 моль / с.

Числа оборотов большинства ферментов находятся в интервале 0,5 - 10⁻⁴ с⁻¹. Величина K_m не имеет такого простого смысла. Только в случае, когда k₋₁ >> k₂, K_m можно приравнять константе диссоциации K_S. Если это условие выполнено, то K_m становится мерой прочности фермент-субстратного комплекса ES: большим значениям K_m соответствует слабое связывание субстрата ферментом, малым значениям K_m – сильное связывание. Обычно K_m можно выразить через три константы скорости, из которых одну константу, k₂, в принципе можно получить из уравнения

υ_m

[E]_O = ———.

k₂

Можно сказать, что K_m – это концентрация субстрата, при которой скорость реакции будет равна половине максимальной скорости (υ_m).

Тем не менее, значения K_m обычно приводят наряду с величинами υ_m и k₂ как количественный параметр ферментативной реакции. Причина состоит в том, что K_m зависит от рН среды, температуры, природы субстрата и других факторов. Поэтому ее значение может служить для того, чтобы характеризовать конкретную фермент-субстратную систему в определенных условиях. В большинстве случаев K_m находится в интервале от 10⁻¹ до 10⁻⁶ моль/л.