Ферментативное расщепление РБ

Хроматографическая очистка инсулина.

Получение кристаллов ГИЧ.

Создание штамма-продуцента инсулина человека.

Перед началом исследований по разработке технологии получения инсулина в распоряжении исследователей был созданный в ИБХ РАН штамм-продуцент E.coli JM109pPINS07, для создания которого была использована рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07 с молекулярной массой 3,3 МДа (5051 п.о.), кодирующая рекомбинантный белок (РБ), в котором последовательность иммуноглобулин-G-связывающего домена В белка А St. aureus соеди­нена через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью про­инсулина человека.

Штамм JM109pPINS07 исходно использовался при разработке процесса получения инсулина. Созданная на его основе технология позволяла получить ГИЧ фармакопейного качества с приемлемым выходом, но продуктивность штамма и эффективность очистки все еще оставалась недостаточно высокой. В ходе многочисленных экспериментов исследователями был создан новый штамм E. coli BL07 – продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина человека путем трансформации клеток E. coli BL21 плазмидой pPINS07 с помощью электропорации.

Полученный штамм E. coli BL21/pLP-3-1, названный E.coli BL07 обладал значительными преимуществами перед штаммами-продуцентами использованными ранее. Это, в частности, возрастание внутриклеточного содержания рекомбинантного препроинсулина человека как следствие инактивации в плазмиде некоторых генов, кодирующих бактериальные белки. Кроме того, в клетках нового штамма отсутствовали продукты деградации предшественника инсулина, затрудняющие его очистку.