Ферментативное расщепление рекомбинантного белка и выделение инсулина

Следующая стадия включала процесс расщепления РБ под действием протеолитических ферментов и концентрирование продуктов гидролиза. Исследования показали, что оптимально ферментативный процесс осуществляется смесью трипсина и карбоксипептидазы В (CpB) в соотношении РБ-трипсин-CpB 4000: 1-2: 1. Последний, под действием CpB расщепляется с образованием целевого продукта – инсулина человека. Концентрирование продуктов гидролиза осуществляли солевым осаждением, при этом достигалась дополнительная очистка ГИЧ от низкомолекулярных примесей.

Кроме инсулина, С-пептида и фрагментов лидерной последовательности РБ в ходе ферментативного гидролиза могут образовываться различные «инсулиноподобные» пептиды, а также А21-дезамидоинсулин (8-12%), количественное содержание которых строго номинируется в конечном продукте. Инсулиноподобные пептиды при анализе ОФ ВЭЖХ элюируются до или после инсулина и условно обозначаются как “гидрофильные” и “гидрофобные”. Очистка инсулина от гидрофильных примесей является крайне затруднительной и приводит к значительному снижению выхода целевого продукта.

Использование разработанного штамма-продуцента BL07, позволило получить РБ, гидролизат которого практически не содержит гидрофильных инсулиноподобных пептидов. Это значительно упростило задачу разделения смеси продуктов ферментативного гидролиза РБ.

После достижения максимума концентрации инсулина при минимальном содержании примесей гидролиз останавливали, подкисляя раствор до рН 3,5. Гидролизат обрабатывали хлоридом натрия или ацетатом цинка, осаждая инсулин, в результате получали осадок инсулина сырца с содержанием целевого продукта до 90%.

Стадия ферментативного расщепления гибридного белка была масштабирована в десятки раз, без потери качества и количества получаемого инсулина. Из 792 г РБ получали 202 г инсулина.

Хроматографическая очистка инсулина на гидрофобном сорбенте.

Финишная очистка инсулина на анионите и гель-фильтрация.