Разработка технологии культивирования штамма-продуцента инсулина

Изучение процесса культивирования продуцента позволило разработать технологию, состоящую из ниже описанных стадий.

1.2.1. Приготовление посевного материала.

Эталонную (музейную) культуру штамма-продуцента дважды последовательно высевали на агаризованной питательной среде. Отобранные клоны проверяли на продуктивность РБ методом электрофореза на полиакриламидном геле. Уровень накопления гибридного белка должен быть не менее 30% от суммы всех белков клетки. Далее для выращивания маточной культуры в колбу с жидкой питательной средой вносили несколько типичных колоний рабочей культуры и выдерживали при +37^оС. Готовая маточная культура имела оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 7,5 оптическим единицам (ОЕ); рН 5,1 и типичную морфологию клеток при отсутствии посторонней микрофлоры. Инокулят, получаемый из маточной культуры, имел оптическую плотность при длине волны 540 нм, равную 4,3 ОЕ; рН 6,1 и был использован на стадии биосинтеза.

1.2.2. Биосинтез РБ.

Выращивание штамма-продуцента проводили в биореакторе (ферментере) объемом 200 л, содержащем питательную стерильную среду. В ферментер засевали инокулят и проводили биосинтез при температуре +37^оС, рН 7,0, рО₂ - 55% от насыщения и давлении в аппарате 0,25 атм. Температуру, рН, давление в аппарате поддерживали автоматически. При достижении необходимой оптической плотности культуральной жидкости культуру непрерывно подпитывали раствором глюкозы. В ходе культивирования в ферментер вносили раствор ампициллина и проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактозидом (ИПТГ). Через 4-5 ч. После добавления индуктора процесс останавливали. Общее время культивирования составляло 12-13 ч.

Съем сырой биомассы с 1 л культуральной жидкости – 55 г, содержание влаги – около 70%, содержание рекомбинантного белка в клетках биомассы – 25-30 %[*].

1.2.3. Получение биомассы.

Культуральную жидкость центрифугировали с помощью проточной центрифуги. Средний съем сырой биомассы – 11 кг, влажность - 72%, содержание РБ в биомассе – 27-30%.

1.2.4. Разрушение клеток и выделение телец включения.

Подготовленную суспензию клеточной биомассы разрушали на проточном дезинтеграторе при повышенном давлении в 600 атм. за 3-4 цикла дезинтеграции. Разрушение клеток контролировали по накоплению растворимого белка, степень разрушения клеток оценивали визуально с помощью микроскопа. Степень разрушения клеток составляла 90-95%. Дезинтегрированную суспензию клеток далее подавали на вращающийся ротор проточной центрифуги. Скорость подачи не более 1 л/мин. Вес влажного осадка телец включения (ТВ), содержащих рекомбинантный белок, составлял около 3 кг (15 г/л КЖ), содержание влаги около 80%, содержание РБ около 50%.