Методична розробка

По підготовці та роботі на лабораторному занятті №35

Для студентів медичного факультету

Тема: Спорові та аспорогенні анаеробні бактерії – збудники ранової газової інфекції та гнійно-запальних процесів. Морфологія і біологічні властивості. Мікробіологічна діагностика захворювань.

1.1. Актуальність теми. Анаеробні мікроорганізми досить часто викликають гнійно-запальні захворювання людини в асоціації з факультативно-анаеробними і аеробними бактеріями. Особливо небезпечним для життя людини є розвиток ранової клостридіальної інфекції, яка супроводжується токсичним ураженням продуктами розпаду тканин нирок, центральної нервової системи, тощо. Особливістю цієї групи ранових інфекцій також полягає у важкості лікування в силу резистентності клостридій до більшості хіміотерапевтичних засобів, а також їх недосяжності у вогнищі запалення за рахунок порушення нормального кровообігу. Такі особливості перебігу ранової анаеробної інфекції зумовлюють провідну роль профілактики подібних ускладнень. Знання біологічних особливостей збудників, їх екології і умов, за яких спори клостридій набувають можливості до проростання у контамінованих тканинах, необхідне майбутньому лікарю для проведення повноцінних профілактичних заходів з метою попередження розвитку анаеробної інфекції.

1.2. Цілі вивчення теми.

6.1.3. Мета загальна: засвоїти основні біологічні властивості збудників ранової газової інфекції та гнійно-запальних процесів, принципи лабораторної діагностики, специфічної профілактики і лікування інфекцій.

6.1.4. Мета конкретна:

6.1.4.1.Засвоїти основні біологічні властивості клостридій, збудників газової анаеробної інфекції, умови спороутворення і гермінації спор в рані.

6.1.4.2.Знати механізми дії токсинів збудників ранової газової інфекції та гнійно-запальних процесів.

6.1.4.3.Вміти правильно обрати метод лабораторної діагностики ранової газової інфекції та гнійно-запальних процесів (попередня і остаточна)

6.1.4.4.Знати шляхи проникнення клостридій і неспороутворюючих анаеробів в організм людини, умови для виникнення гнійно-запального процесу в рані.

6.1.4.5.Вміти правильно призначити препарати для лікування ранової газової інфекції та гнійно-запальних процесів.

6.1.4.6.Знати основні біологічні властивості неспороутворюючих анаеробів, збудників гнійно-запальних процесів.

1.3. Забезпечення вихідного рівня знань-умінь.

20. Значення спороутворення у бактерій, методи виявлення спор, чутливість спор до дії несприятливих фізико-хімічних факторів.

21. Методи культивування і виділення чистих культур анаеробних бактерій.

22. Екзотоксини, загальна характеристика. Класифікація.

23. Ферменти патогенності, приклади, визначення.

24. Анатоксини, спосіб отримання, характеристика, застосування.

25. Антитоксичні сироватки, отримання, застосування.

26. Реакція нейтралізації токсину антитоксином. Постановка in vivo і in vitro.

1.4. Зміст навчання.

1.4.1. Граф логічної структури змісту:

1. Класифікація патогенних для людини анаеробів – збудників газової ранової інфекції і гнійно-запальних ускладнень

№№	Назва роду	Патогенні види
Неспороутворюючі анаероби
	Bacteroides	B. fragilis, B.melaninogenicus
	Fusobacterium	F.nucleatum, F.necroforum
	Propionobacterium	P. acnes, P.avidus
	Peptococcus	P. niger
	Peptostreptococcus	P. anaerobius
	Veilonella	V.atipica, V.dispar
Спороутворюючі анаероби
	Clostridium	C. perfringens C. novi C. septicum C. hystolyticum C. difficile C. sporogenes

2. Роль неспороутворюючих анаеробів у розвитку інфекцій

Викликають ендогенні гнійно-запальні інфекції в асоціаціях з факультативними анаеробами або аеробами:

А) м’яких тканин (флегмони, абсцеси, нагноєння трофічних виразок, ранові інфекції)

Б) дихальної системи (абсцеси легенів, емпієма плеври та ін.)

В) опорно-рухової системи (остеомієліти)

Г) сечо-статевої системи

Д) стоматологічні захворювання (глибокий карієс, періодонтити, періостити, пародонтити, хелітозіс та ін.).

3. Умови розвитку захворювань

1) порушення тканинних бар’єрів шкіри і слизової оболонки

2) зменшення рівня кисню і окисно-відновного потенціалу у тканинах внаслідок травм, спазмів або порушення проникливості судин

3) хірургічні втручання (операції на кишечнику, у щелепно-лицевій ділянці)

4) цукровий діабет, онкозахворювання, лейкози, артеріосклероз, ендартеріїт, алкоголізм

5) тривале застосування препаратів з імуносупресивною дією (кортикостероїди, імунодепресанти, антибіотики

6) рентгенівське та гама-опромінення

4. Лабораторна діагностика інфекцій, викликаних неспороутворюючими анаеробами

Матеріал для дослідження: рановий вміст, ексудат та ін.(витримують в спеціальних контейнерах, наповнених інертним газом)

Методи діагностики:

Бактеріоскопічний – попередня діагностика

Бактеріологічний – оснований на виділенні чистої культури збудника та її ідентифікації за ферментативними властивостями

Біологічний – проводять зараження білих мишей та кролів за умов забруднення досліджуваного матеріалу сторонніми мікроорганізмами

5. Збудники газової анаеробної інфекціі

Морфологія (загальна характеристика) Грам-позитивні спороутворюючі палички, які під час споруляції набувають веретеноподібної форми; Не утворюють капсулу (крім C. perfringens); Малорухомі перитрихи (крім C. perfringens)	Умови культивування, середовища, ознаки росту Облігатні анаероби; оптимальне рН 7,2-7,6; Культивують на спеціальних середовищах для анаеробів: середовище Кітта-Тароцці, кров’яно-цукровий агар Цейслера, середовище Вільсон-Блера, середовище Вілліса_Хобса
C.perfringens Грам (+) товста, «цеглино подібна паличка» (1,5-2,0x4-8 мкм); утворює центрально або субтермінально розташовану овальну спору; має капсулу; не рухомі	Оптимальна температура культивування +30-370С Утворюють R-форми колоній на щільних середовищах. В середовищі Кітта-Тароцці дає дифузне помутніння і велику кількість газу. молоко – швидке його зсідання (3-5 годин - „штормова реакція” (бурхливе виділення газу і утворення губчастого згустку) середовище Вільсона-Блера - викликає почорніння і утворення розривів середовища
Класифікація патогенних клостридій за ферментативними властивостями
Переважно цукролітичні клостридії C. perfringens, C. septicum	Переважно протеолітичні клостридії C. novyi, C. hystoliticum

6. Коротка характеристика особливостей патогенезу, клінічного перебігу і лабораторної діагностики газової анаеробної інфекції

Фактори патогенності	Патогенез	Клінічні прояви	Лабораторна діагностика	Профілактика і лікування
3. Ферменти патогенності 3. Багатофракційні екзотоксини: основні (α, β, ε, ι) мінорні (δ, τ, κ, µ, ξ та ін.) 4. Капсула	Дія екзотоксинів: гемолітична, дермонекротична, летальна, ентеротоксична, нейротоксична, кардіотоксична, нефротоксична. Пускова ланка: руйнація a-токсином клітин у місці ураження, що уможливлює подальший процес протеолізу тканин	3 клінічні форми газової анаеробної інфекції: емфізематозна набрякова змішана Характерно: відсутність яскравих ознак запалення у рані, швидко прогресуючий некроз тканин і наявність вираженої інтоксикації	Методи: 1.Бактеріоскопічний (попередня діагностика) 2. Бактеріологічний (основний) 3.Біологічний 4. Імунохімічний	Профілактика: Неспецифічна - ПХО рани Специфічна - полівалентна протигангренозна гетерологічна сироватка Лікування Неспецифічне – антибіотики (цефалоспорини або пеніциліни) Специфічне - видоспецифічні антитоксичні сироватки

1.4.2. Перелік теоретичних питань.

1. Морфологія і культуральні властивості клостридій анаеробної інфекції.

2. Фактори патогенності клостридій анаеробної інфекції, патогенетична дія їх токсинів і ферментів.

3. Умови виникнення анаеробної газової інфекції, основні прояви в рані.

4. Мікробіологічна діагностика захворювання.

5. Специфічна профілактика та терапія ранової анаеробної інфекції.

6. Основні представники неклостридіальних анаеробних бактерій родини бактероїдів, пептококів, вейлонел. Їх роль в виникненні гнійно-запальних ускладнень ранового процесу.

1.7.3. Джерела навчальної інформації.

Література (основна):

1. К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, К., 1982. Стор. 269-274, 314-315.
2. К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, М., 1980. Стр. 322-329,333-334.
3. В.Д.Тимаков.Микробиология, 1983. Стр. 323-330, 336-340.
4. А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петерб.,2002. Стр.423-427.
5. И.Л.Дикий, И.Ю.Холупяк, Н.С.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999. Стр.286-291.
6. Микробиология. Руководство к лабораторным занятиям. Под ред. И.Л.Дикого, Харьков, 1999. Стр.310- 314, 316-317, 318.
7. С.І.Климнюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоков. Практична мікробіологія. Тернопіль, 2004. Стор.249-256.
8. Л.Б.Борисов. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии, 1984. Стр. 141-147.
9. Л.Б.Борисов. Медицинская микробиология, вирусология,иммунология, М., 2002. Стр. 448-453.
10. Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1973. Стр. 147-150.
11. М.Н.Лебедева. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. М., 1973. Стр.267-270.

Література (додаткова):

1. Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Загальна ред.. Г.К.Палій, К., 2004.
2. А.Н.Маянский. Микробиология для врачей. Н.Новгород, 1999. Стр.139-152, 153-164.
3. Лекційний матеріал.

1.8. Орієнтовна основа дії (ОДД)

Схема мікробіологічної діагностики газової анаеробної інфекції

Матеріал для дослідження: некротизовані тканини, ексудат з ран, перев’язувальний та шовний матеріал, чужорідні предмети.

Бактеріоскопічне дослідження

- мазок, забарвлення за Грамом;

- мазок, забарвлення метиленовим синім;

- мазок, забарвлення за Буррі-Гінсом;

- РІФ.

Відповідь.

Бактеріологічне дослідження

- посів на середовище Кітта-Тароцці, Вільсон-Блера, молоко, середовище Вілліса-Хобса;

- пересів на глюкозо-кров’яний агар;

- характер колоній;

- мазок, забарвлення за Грамом;

- препарат “роздавлена крапля” для виявлення рухливості;

- пересів на середовище Кітта-Тароцці (чиста культура);

- посів на вуглеводний ряд Гіса, желатину;

- реакція нейтралізації токсину антитоксином.

Відповідь.

Прискорений метод.

- лецитиназна проба для виявлення токсину перфрінгенс в досліджуваному матеріалі за допомогою діагностичної сироватки анти-perfringens.

Відповідь.

Біологічне дослідження.

- РН з метою встановлення типу токсинів в дослідах на мишах, заражених сумішшю матеріалу та специфічних антитоксичних сироваток.

Відповідь.

Диференційні ознаки патогенних клостридій – збудників газової анаеробної інфекції

Вид	Цукролітичні властивості	Розрідження желатину	Ріст у молоці	Колонії на середовищі Вілліса-Хобса
лактоза	глюкоза	маніт
C.perfringens	+ (КГ)	+ (КГ)	-	+	Швидке згортання («штормова реакція»)	Червоні, з зоною опалесценції (за рахунок розщеплення лактози і утворення лецитинази)
C.hystoliticum	-	-	-	+	Швидке згортання і пептонізація	Безбарвні, без зони опалесценції (лактозо- і лецитиназонегативні)
C.novyi	-	+	-	+	Повільне згортання	Безбарвні з зоною опалесценції (лактозо-негативні, але утворюють лецитиназу)
C.septicum	+(КГ)	+(КГ)	-	+	Повільне згортання	Безбарвні з зоною опалесценції
C.sporogenes	-	+ (КГ)	-	+	Повільне згортання	Безбарвні, без зони опалесценції (лактозо- і лецитиназонегативні)
C.sordelii	-	+(КГ)	-	+	Повільне згортання	Безбарвні з зоною опалесценції (лактозо-негативні, але утворюють лецитиназу)
C.difficile	-	+	+	+	Не згортає	Безбарвні, без зони опалесценції (лактозо- і лецитиназонегативні)

1.7. Короткі методичні вказівки для роботи студентів на лабораторному занятті.

1.7.1. Методика проведення заняття.

1. Приготувати мікропрепарати зі спорових культур клостридій, засіяних на молоко, забарвити їх за Грамом, Ціль-Нільсеном, промікроскопувати, звертаючи увагу на морфологію вегетативних клітин, на розмір, форму і розміщення спор.

2. Вивчити характер росту клостридій газової інфекції на середовищах Кітта-Тароцці, Вільсон-Блера, кров’яному агарі, молоці.

3. Вивчити в демонстраційному досліді на середовищах Гіса диференційні біохімічні властивості клостридій анаеробної інфекції.

4. Здійснити дослід на виявлення токсину клостридій перфрінгенс в рановому виділенні за його лецитиназною активністю з метою прискореної діагностики клостридіозу. Для цього в три пробірки вноситься по 0,3 мл досліджуваного матеріалу, в дві з них – по 0,1 мл лецитину, далі в першу додається 0,1 мл сироватки антиперфрінгенс, в другу – 0,1 мл, а в третю – 0,2 мл фізіологічного розчину. Облік результатів здійснюється через 40 хвилин інкубації в термостаті. В першій пробірці розчин залишається прозорим (нейтралізація токсину антитоксином), в другій – позитивний результат у вигляді помутніння (розщеплення лецитину), в третій – вміст залишається прозорим (контроль).

5. Ознайомитись з лікувально-діагностичними препаратами, які застосовують при клостридіозах.

6. Внести в протокол дані про морфологічні особливості неспороутворюючих анаеробів, збудників гнійно-запальних ускладнень.

7. Оформити протокол, зробити висновки.

Автор: доцент, к.м.н. Вовк І.М.