Вопрос 6Биотехнология

Охарактеризуйте специфику биотехнологических методов получения препаратов-пробиотиков.

Пробиотики — живые организмы и/или вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, а также на биохимические и поведенческие реакции организма хозяина, оптимизируя его микробиологический статус.

Специфика биотехнологических методов получения препаратов-пробиотиков состоит в том, что, штаммы микроорганизма симбионта должны быть совместимыми с организмом человека, т.е. выделяться, например, из кишечного содержимого здоровых детей и взрослых, как это было в случае со штаммом Enterococcus faecium, который был выделен из кишечника ребенка. Во-вторых, выделенные штаммы обязательно надо идентифицировать. Дело в том, что для получения пробиотиков разрешены штаммы только определенных видов микроорганизмов. Эти штаммы должны обладать следующими свойствами:

• эффективной антагонистической активностью, обеспечиваемой в свою очередь синтезом органических кислот, которые штамм должен активно продуцировать. При выделении штаммов бифидобактерий важным антагонистическим началом продуктов метаболизма являются муравьиная и молочная кислоты. Желательно также, чтобы эти штаммы продуцировали пероксиды и антибиотикоподобные вещества;

• эффективной способностью прикрепляться к эпителию кишечника, если речь идет о пристеночных микроорганизмах;

• не гидролизовать кишечную слизь, которая обладает протективным действием. Некоторые микроорганизмы продуцируют мукополисахариды, которые разрушают (гидролизуют) эту слизь;

• не повреждать клетки кишечного эпителия (холециты). Отобранные штаммы обязательно проверяют на патогенность и токсичность in vitro на культуре клеток холецитов, на чувствительных животных. Побочные эффекты у пробиотиков не должны

проявляться даже при их избыточных дозах. Для проверки препарат вводят в организм чувствительных животных в больших количествах, иногда до нескольких граммов на килограмм веса.

Штаммы должны быть технологичны, т.е. хорошо расти и размножаться на искусственных питательных средах. Их обрабатывают методом лиофилизации: замораживают до низких температур и затем высушивают при низком давлении. Соответственно, отобранные штаммы должны быть криорезистентны и выдерживать процедуру высушивания.

Удовлетворяющие всем этим требованиям штаммы поступают в контрольный институт, откуда их передают в фармацевтическое производство с соответствующими документами, в которых отражены их характеристики. В заводских лабораториях штаммы высеивают на искусственные питательные среды, проверяют их соответствие паспортным данным (род, вид, биологические свойства). И только после этого используют для получения препаратов пробиотиков. В условиях промышленного производства эти штаммы рассеивают и получают отдельные колонии, которые затем пересевают на агаризованные или жидкие питательные среды (например, молочнокислые бактерии хорошо растут в обезжиренном молоке).

И бифидобактерии, и лактобациллы, и энтерококки — это ауксотрофы, т.е. для своего роста они нуждаются в ряде питательных веществ и микроэлементов, не могут сами синтезировать аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины: их должна содержать питательная среда. Для культивирования этих бактерий используют такое сырье, которое разрешено к применению в пищевой промышленности, так как препарат, выращенный на этих средах, впоследствии используется для внутреннего применения.

Обычно молочнокислые бактерии культивируют от 8 до 16 ч (довольно короткая ферментация). Собирают штаммы в той фазе роста, при которой выживание клеток культуры будет наиболее длительным, что в свою очередь, при дальнейшем получении препарата, обеспечивает его длительное хранение. Все это опре­деляется экспериментальным путем и часто является ноу-хау фирмы-производителя. Как правило, выбирают конец логарифмиче­ской фазы или начало стационарной, в зависимости от культуры (штамма). По завершении процесса культивирования получают бактериальную суспензию, содержащую в 1 мл 10⁹ и более клеток. Эти клетки собирают, используя поточные центрифуги или сепараторы, в которых образуется похожая на сметану с кремовым оттенком масса со специфическим запахом кислого молока (напоминает прессованные дрожжи). Раствор криопротекторов (вещества белковой природы — обезжиренное молоко или желатин; углеводы — лактоза, сахароза) добавляют в проточную массу и получают густую суспензию клеток, которую разливают в ампулы. Затем их замораживают в жидком азоте и подвергают лиофильной сушке. Сухая масса приобретает пузырчатый вид. Ее измельчают и определяют титр, в соответствии с которым вносят во флаконы (стеклянные, пластмассовые) или смешивают с культурой другого штамма. В последнем случае получают несколько видов микроорганизмов симбионтов.