Темнопольная микроскопия

Руководство

к лабораторным занятиям по микробиологии

для студентов фармацевтических вузов и

фармацевтических факультетов

Под редакцией доктора медицинских наук, профессора, академика АНТК Украины И.Л.Дикого

Харьков – 2000

РАЗДЕЛ «МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ»

Тема: Виды микроскопии: назначение и принципы применения

Цель: Ознакомиться с принципами и методами изучения морфологии микроорганизмов.

Микроорганизмы можно увидеть при помощи оптического при­бора – микроскопа. Микроскоп (от греч. micros – малый и scopeo – смотрю) служит для изучения малых объектов, невиди­мых невооруженным глазом. В микробиологии микроскоп используется для исследования как живых, так и убитых микробов, в окрашенном или неокрашенном виде. В микробиологической практике, в зависимости от целей объективов исследования, применяют различные виды микроскопий: светопольную, фазово-контрастную, аноптральную, люминисцентную, электронную.

Вопросы для самоподготовки

1. Виды микроскопии: светопольная, темнопольная, фазово-контрастная, аноптральная, люминес­центная, электронная.

2. Устройство светопольного микроскопа и правила работы с ним. Иммерсионная система увеличения.

Литература

1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробио­ло­гия. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 18-50.

2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руково­дство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 9-35.

Светопольная микроскопия.

Устройство светопольного микроскопа ипорядок работы с ним

Обычная светопольная (или световая) микроскопия предназначена для изучения окрашенных микроскопических препаратов, которые интенсивно поглощают свет.

На рис. 1 изображен светопольный биологический микроскоп. Его механическая часть состоит из основания (или штатива), коробки с микромеханизмом, предметного столика, тубусо­держателя, бинокуляра, револьвера с объективами.

В штативе различают нижнюю часть (или ножку), и верхнюю часть (или колонку). К колонке, которая служит ручкой для переноса микроскопа, прикреплен подвижный предметный столик, на кото­рый помещается исследуемый объект. Он имеет центрировку и при помощи винтов передвигает препарат в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Отсчет перемещения в обоих направлениях может производиться по шкалам и нониусу с точностью до 0,1 мм.

К верхней части колонки присоединяется труба микроскопа – тубус. Тубус является подвижной трубкой, к которой прикрепляются линзы, служащие для увеличения исследуемого объекта. Тубус приводится в движение вверх и вниз двумя системами винтов: макровинтом и микровинтом для тонкой фокусировки.

Для грубой наводки служит зубчатка, или кремальера, при­водимая в движение макрометрическим винтом. Этим винтом пользуются при малых увеличениях, а также при больших увеличениях для грубой первоначальной установки. Перемещение ту­буса рукояткой макровинта возможно в пределах 50 мм.

Для более точной установки служит микрометрический винт. На правой рукоятке тонкой фокусировки закреплен барабан со шкалой, разделенной на 50 частей. Цена одного деления шкалы барабана 0,002 мм. Один оборот барабана соответствует перемещению тубуса на 0,1 мм. Общая величина перемещения ту­буса от упора до упора равна 2,2-2,4 мм. Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа, и обращение с ним требует особой осторожности.

Передвигая ту­бус при помощи этих двух винтов, его устанавливают так, чтобы получить наиболее ясную микроскопическую картину; это достигается, когда расстояние от рассматриваемого объекта до объектива равно фокусному расстоянию этого объектива.

Верхняя часть тубусодержателя заканчивается головкой, служащей для крепления револьвера и тубуса. В верхней части тубуса расположен окуляр, а к нижней части его прикреплен револьвер, в гнезда которого ввинчива­ются объективы. Револьвер вращается вокруг своей оси, что позволяет поставить тот или другой объектив при желании по­лучить большее или меньшее увеличение.

Оптическая часть микроскопа состоит из объективов, оку­ляра и осветительного устройства.

Осветительное устройство находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало служит для отражения световых лучей по направлению к объек­тиву и через него внутрь микроскопа. Одна сторона зеркала плоская, другая вогнутая. Плоским зеркалом пользуются при дневном рассеянном свете, а вогнутым – при искусственном ос­вещении.

Конденсор представляет собой двояковыпуклую линзу, прикрепляемую снизу предметного столика с таким расчетом, чтобы линза конденсора располагалась под отверстием предмет­ного столика. Конденсор служит для собирания (конденсации) пучка световых лучей, что обеспечивает наибольшее освещение исследуемого предмета.

При микроскопировании с дневным светом конденсор необ­ходимо поднять до уровня предметного столика; при искусст­венном освещении конденсор опускают до тех пор, пока при ма­лом увеличении изображение источника света не появится в плоскости препарата. При микроскопии неокрашенных препаратов конденсор следует также опустить.

Между зеркалом и конденсором помещается диафрагма, кото­рая регулирует объем лучей, падающих на объектив. Она состоит из стальных лепестков и при помощи рычага может менять свой диаметр. Окрашен­ные препараты следует рассматривать при открытой диафрагме; при изучении неокрашенных препаратов необходимо открыть отверстие диафрагмы.

Объективы представляют собой систему двояковыпуклых линз, заключенных в металлическую оп­раву. Передняя (фронтальная) линза объектива является главнейшей, производящей увеличение. Лежащие за ней линзы корригируют изображе­ние и поэтому называются коррекционными.

Степень увеличения исследуемого объекта зависит от кри­визны линзы используемого объектива. Чем меньше кривизна линзы, тем меньше увеличение и, наоборот, чем больше кривизна линзы, тем больше увеличение. Обычно объек­тивы микроскопа имеют цифровое обозначение длины фокусного расстояния, которое зависит от кривизны линзы: чем более выпукла поверхность линзы, тем меньше фокусное расстояние и тем больше получаемое увеличе­ние.

Характеристика объектива состоит из его собственного увеличения, фокусного расстояния, численной апертуры. Чем меньше фокусное расстояние, тем сильнее объектив, больше его собственное увеличение. На корпусе объектива выгравированы обозначения собственного увеличения (´8, ´20, ´40, ´90) и численная апертура. Численная апертура – произведение пока­зателя преломления среды на синус половины отверстого угла – для объектива характеризует угол, под которым еще может вхо­дить в объектив наклонный луч. Кроме этих обозначений, на корпусе объективов апохроматов пишется «апохр» и на иммерси­онных «ОИ» или «МИ» – объектив иммерсионный (масляный) или «ВИ» – вод­ная иммерсия.

Объективы бывают двух систем: ахроматы и апохроматы. Ахроматы устроены проще, но имеют ряд недостатков, которые устранены в более сложных апохроматических объективах. При применении объективов апохроматов достигается полная яс­ность изображения и устраняется хроматическая аберрация. По­следнее особенно важно при микроскопии цветных объектов. Все объективы (ахроматы и апохроматы) разделяются на сухие и им­мерсионные. Если между объективом и рассматриваемым препара­том находится воздух, то подобный объектив называется сухим. Если же объектив погружен в жидкость, заполняющую пространство между его фронтальной линзой и препаратом, то подобный объектив называется погруженным, или иммерсионным (immersio – погружаю). При исследова­нии микробов применяется исключительно иммерсионная, или по­гружная, система объективов.

Иммерсионные объективы имеют преимущество перед сухими. Сравнительный ход световых лучей в сухой и иммерсионной системах представлен на рис. 2. При микроскопии с помощью сухой системы световые лучи, иду­щие от зеркала через конденсор в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателями преломления. Так, из воздуха (показатель преломления 1,0) пучок световых лучей попадает в стекло (показатель преломления 1,5), затем опять в воздух и, наконец, во фронтальную линзу объектива. При каждом из этих переходов часть лучей, преломляясь на границе разнородных сред, отклоняется в сторону и не попа­дает в объектив. В результате поле зрения освещается недос­таточно, что особенно важно при пользовании сильными увеличительными систе­мами, где очень малы фронтальные линзы. Чтобы избежать этого, объектив погружают в каплю жидкости (иммерсионное масло, вода), показатель преломления которой близок к пока­зателю преломления стекла. Вторую каплю этой же жидкости на­носят на конденсор. Таким образом, конденсор, жидкость, пре­парат, жидкость и объектив представляют собой единую сис­тему, не вызывающую отклонения светового луча.

Окуляр (от латинского слова oculus – глаз) состоит из двух плосковыпуклых линз (собираю­щей и глазной). Он увеличивает изображение, получаемое с помощью объектива, в 7, 10 или 15 раз. Такие простые окуляры обычно применяют с ахроматическими объективами. При работе с апохроматами нужно использовать специальные, так называемые компенсационные, окуляры. В них линзы подобраны таким обра­зом, что они дают хроматическую ошибку, обратную остаточному хроматизму апохромата и потому ее компенсирующую. Следует иметь в виду, что увеличивает объект только объектив, окуляр же увеличивает не исследуемый предмет, а только его изобра­жение, получаемое в объективе.

Общее увеличение микроскопа равняется произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, например, комбинация иммерсионного объектива 90 с окуляром 10 дает увеличение объекта в 900 раз.

Качество микроскопа зависит не только от увеличения ис­следуемого объекта, но и определяется его разрешающей силой. Под последней следует понимать то наименьшее расстояние ме­жду двумя точками препарата, изображения которых можно от­четливо различить под микроскопом. Чем меньше это расстоя­ние, тем больше разрешающая сила.

Разрешающая сила биологического микроскопа с иммерсион­ной системой равна 0,2 мкм. Следовательно, при пользовании та­ким микроскопом пределом видимости являются объекты размером не меньше 0,2 мкм.

Нужно помнить, что иммерсионный объектив требует особого бережного обращения с ним. Опускать этот объектив нужно ос­торожно, чтобы не раздавить стекло препарата, что влечет за собой порчу фронтальной линзы. Погружать иммерсионный объек­тив в каплю масла на предметном стекле надо под контролем глаза, наблюдая сбоку, причем глаз должен находиться на уровне предметного столика. После погружения объектива в ка­плю масла, глядя в окуляр, при помощи макрометрического винта осторожно опускают тубус микроскопа, пока не находят в поле зрения контуры препарата. Затем с помощью микро­метрического винта устанавливают точное изображение объекта.

По окончании микроскопирования поднимают тубус микро­скопа, а затем снимают препарат; фронтальную линзу осторожно вытирают мягкой тряпочкой, иногда смачивая ее спиртом, раз­веденным водой 1:1.

Освещение. При работе с конденсором Аббе независимо от источника света нужно поль­зоваться только плоским зеркалом.

Осветительное устройство (или осветительный аппарат Аббе) составляют зеркало, ирис-диафрагма и конденсор. Зер­кало, благодаря тому, что его оправа вмонтирована в специ­альной вилке, может вращаться в двух взаимно перпендикуляр­ных направлениях. Одна из отражающих поверхностей зеркала плоская, другая вогнутая.

Современная ирис-диафрагма, сокращаясь по типу зрачка, позволяет регулировать величину светового пучка, поступаю­щего в конденсор. Это важно потому, что светосила (апертура) конденсора всегда должна быть немного меньше, чем у объек­тива.

Конденсор представляет собой систему линз, вмонтирован­ных в коническую металлическую оправу. Чем больше линз, тем больше светосила конденсора. Для получения отчетливого изо­бражения необходимо, чтобы препарат оказался в фокусе кон­денсора. С этой целью конденсор передвигается в вертикальном направлении в пределах 20 мм.

Ход лучей. Пучок света, отраженный зеркалом, через диа­фрагму попадает в конденсор. Преломившись в его линзах, лучи попадают на препарат в виде конуса, вершина которого обра­щена к препарату. Пройдя сквозь препарат, лучи вновь расхо­дятся в виде конуса и попадают в объектив. Преломившись в линзах объектива, лучи на выходе из него дают увеличенное, но обратное изображение. Это изображение строится лучами на некотором расстоянии от задней линзы объектива, на уровне диафрагмы окуляра, т. е. в финальной плоскости глазной линзы. Из окуляра лучи проходят в глаз, и на его сетчатке возникает мнимое, увеличенное, обратное изображение. Таким об­разом, объектив увеличивает рассматриваемый предмет, а оку­ляр увеличивает изображение. Следовательно, способность мик­роскопа к увеличению есть сумма увеличений, обеспечиваемых объективом и окуляром. Большинство объективов дает наилучшее изображение при длине тубуса 160 мм, а окуляры, как правило, рассчитаны на расстояние 250 мм, что соответствует расстоя­нию нормального невооруженного глаза от читаемого текста.

Общее увеличение микроскопа (V) может быть определено с учетом этих данных по формуле:

,

где F_об – фокусное расстояние объектива;

F_ок – фокусное расстояние окуляра.

Хорошее освещение достигается при установке света по ме­тоду Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоя­нии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити на­кала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конден­сора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму кон­денсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображе­ния диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. С помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было ос­вещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь умень­шит контрастность за счет рассеянного света.

Общие правила работы с микроскопом. Современный микроскоп – это оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Они касаются обращения с прибором и ухода за ним, а также применения правильного освещения, выбора в каждом конкретном случае наилучшего варианта оптической системы (окуляр – объ­ектив – конденсор) и т. п.

Для защиты от пыли микроскоп нужно хранить под чехлом. Время от времени сле­дует проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее, но только снаружи. Для чистки оптики применяют волосяную кисточку или мягкую ткань, смоченные этиловым спиртом, разбавленным водой (1:1), но ни в коем случае не применяют бензин или ксилол во избежание расклеивания линз. Механические трущиеся части протирают ксилолом или бензи­ном, а затем смазывают маслом.

Темнопольная микроскопия

Движение бактерий и спирохет можно наблюдать в темнопольном, который отличается от обычного светового спосо­бом освещения препарата. В этом случае применяют боковое освещение, в силу чего получается изображение светяще­гося объекта на темном фоне. Принцип темного поля основан на том, что падающие сбоку световые лучи отклоняются плотными частицами (в частности, микробами) и последние благодаря этому представляются глазу наблюдателя ярко светящимися. Бо­ковое освещение в микроскопе можно получить, заменив, обычный осветитель специальным конденсором с затемнением в центре. Такой конденсор задерживает все центральные лучи света и пропускает лишь периферические (рис.3). Вместо специального конден­сора для темного поля можно пользоваться обычным осветите­лем, между двумя линзами которой вставляют кружок черной бу­маги несколько меньшего диаметра, чем линза. Работать надо с сильным источником света (дуговой лампой или обычной лампоч­кой в 200-300 свечей). Техника исследований заключается в следующем. На предметное стекло наносят каплю материала и осторожно накрывают покровным стеклом, чтобы не было пузырь­ков газа. Затем на поверхность конденсора помещают каплю воды или кедрового масла, и предметное стекло с препаратом кладут на эту каплю.

Препарат рассматривают либо через сильную сухую систему (объектив ´40), либо через иммерсионную систему. В последнем случае на покровное стекло также наносят каплю кедрового масла, а к иммерсии привинчивают маленькую муфточку – диа­фрагму, чтобы сузить диаметр просвета объектива.

При микроскопии этим методом лучи, освещающие объект, не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся (рис. 4). Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора (параболоид или кардиоид) или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью.

Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и цен­трируют, как для светлого поля, и, заменив конденсор специ­альным, прибавляют свет до максимума, раскрыв до отказа диа­фрагму и включив реостат осветителя.

Препараты для исследования в темном поле должны быть приготовлены на очень чистых предметных и покровных стеклах определенной толщины: предметные – не более 1,2 мм, покров­ные – 0,17 мм. Готовят препарат по типу "раздавленной" или "висячей" капли (рис. 5). Между препаратом и конденсором помещают иммерсионное масло (каплю его наносят на верхнюю линзу конденсора). После этого, поднимая и опуская конденсор, добиваются появления в поле зрения светлого пятна, которое с помощью специальных регули­ровочных винтов конденсора выводят в середину поля зрения. Затем с помощью нужного увеличения переходят к наблюдению.