2015-02-27
2243
Испытание лекарственного средства на общее число содержащихся в нем грибов проводят также методом прямого посева (см. определение общего числа бактерий). В качестве питательной среды используют среду Сабуро, инкубацию посевов осуществляют при 22,5±2,5°С в течение 5 суток. На чашках учитывают все колонии, даже если их число менее 30.
Определение присутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae
10 г (мл) образца вносят в 100 мл среды обогащения для эктеробактерий (среда № 3), перемешивают и инкубируют при 32,5±2,5°С в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы петлей на среду Эндо и висмут-сульфитный агар, разлитые в чашки Петри. Инкубируют при 32,5±2,5°С в течение 24-48 часов. На среде Эндо энтеробактерии образуют крупные малинового цвета колонии с металлическим блеском (или без него), или розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 2-4мм. На висмут-сульфитном агаре вырастают черные с характерным металлическим блеском колонии или зеленоватые, коричневые. Вышеописанные колонии пересевают каждую в отдельности на скошенный в пробирках агар (среда №1) и после инкубирования при температуре 32,5±2,5ºС в течение 18-20 ч полученные чистые культуры пересевают на среду с феноловым красным (среда №6) для определения ферментации глюкозы (устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый) и среду с нитратом калия (среда № 7) для определения восстановления нитратов в нитриты. О наличии нитратов судят по появлению красного окрашивания после внесения в среду реактива Грисса. Параллельно ставят тест на наличие фермента цитохромоксидазы: полоску фильтровальной бумаги смачивают смесью 1% спиртового раствора нафтола – 1 и 1% раствора N-диметил-р-фенилендиамина (в соотношении 2:3) и на неё наносят чистую культуру исследуемых бактерий. О положительной оксидазной реакции судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 минут.
Если в образце обнаружены грамотрицательные, оксидазонегативные, неспорообразующие палочки, ферментирующие спустя 48 ч после посева глюкозу с образованием кислоты и газа (или только кислоты) и восстанавливающие нитраты в нитриты делают вывод о присутствии в ГЛС энтеробактерий и, следовательно, о непригодности его к использованию.
Количественное определение бактерий семейства Enterobacteriaceae, определение E. coli и Salmonella осуществляют для оценки микробиологической чистоты субстанций, вспомогательных веществ растительного, животного или другого происхождения, которые невозможно подвергнуть антимикробной обработке, и соответствующих ГЛС. При этом используется методика, описанная в дополнении № 1 Фармакопейного комитета МЗ Украины к общей статье ГФ СССР XI "Испытания на микробиологическую чистоту " от 25.12.97 г.
Определение присутствия S. aureus и P.aeruginosa
10 г (мл) образца ГЛС вносят в 100 мл солевого бульона (среда № 8 для накопления S. aureus P.aeruginosa), инкубируют при температуре 32,5±2,5ºС в течение 24-48 ч. При наличии роста бактерий делают пересевы петлей на среды № 9 (для выявления пигмента P.aeruginosa) и № 10 (солевой агар с маннитом для идентификации S. aureus).
Если после инкубирования на среде № 9 вырастают зеленоватые флуоресцирующие колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, выделяющие в среду сине-зеленый пигмент, дающие положительную цитофромоксидазную реакцию, считают, что ГЛС контаминировано синегнойной палочкой.
Если после инкубирования на среде № 10 вырастают золотисто-желтые колонки, окруженные желтыми зонами (подтверждение ферментации маннита), микроскопия которых дает грамположительные кокки, расположенные гроздьями и коагулирующие плазму, считают что ГЛС контаминировано золотистыми стафилококками.
Наличие синегнойных бактерий и золотистых стафилококков в ГЛС свидетельствует о непригодности исследуемого препарата в медицинской практике.
Определение микробиологической частоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием
Антимикробная активность лекарственного препарата не исключает возможности его микробной загрязненности, что может быть обусловлено отсутствием самостерилизующего эффекта в отношении микроорганизмов, которые не входят в спектр его специфического действия. Например, химиотерапевтические препараты, проявляющие активность в отношении грамположительных бактерий, могут быть контаминированы грамотрицательными, антибактериальные антибиотики широкого спектра действия – грибами и т.д.
Уровень микробной загрязненности препарата зависит от типа действия (бактериостатический, бактерицидный), поступления в него микробов с приобретенной устойчивостью, наличия в составе веществ, снижающих антимикробное действие препарата.
С целью избежания ошибок в интерпретации результатов, возможных в связи с проявлением антимикробного действием лекарственного средства, перед определением микробиологической чистоты следует предварительно оценить его антимикробную активность.
Определение антимикробного действия лекарственного средства осуществляют по методике, описанной в ГФ ХI.
Пять образцов испытуемого лекарственного средства по 1г (мл) каждый разводят в соотношении 1:10, используя фосфатный буферный раствор (2 образца), среду № 3 (1 образец) и среду № 8 (2 образца). Характеристика питательных сред приведена выше.
В качестве тест-штаммов используют стандартные культуры из американской типовой коллекции культур, именуемых АТСС (American Type Culture Collection):
· Bacillus subtilis АТСС 6633;
· Escherichia coli АТСС 25922;
· Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027;
· Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р;
· Candida albicans АТСС 885-653.
Культуры S.aurens, E.coci, P.aeruginosa, B.subtilis (B.cereus) выращивают на жидкой среде № 1 при температуре 32,5±2,5°С в течение 18-20 ч; культуру гриба C.albicans выращивают на жидкой среде Сабуро № 2 при температуре 22,5± 2,5°С в течение 48 ч.
Культуры разводят в соотношении 1:1000 стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида изотоническим, вносят по 1 мл в подготовленные образцы. S.aurens P.aeriginosa – в образцы, разведенные средой № 8, E.coci – средой № 3, B.subtilis C.albicans – буферным раствором.
В случае роста тест-штаммов на соответствующих питательных средах при добавлении испытуемого лекарственного средства, его характеризуют как, "не проявляющее антимикробное действие". При последующем определении микробиологической чистоты используют вышеописанную методику прямого посева. Лекарственные средства испытывают в разведении 1:10.
При отсутствии роста тест-штаммов на питательных средах лекарственное средство характеризуют как проявляющее антимикробное действие, которое при определении микробиологической чистоты устраняют с помощью следующих способов:
· увеличивают разведение лекарственного средства, используя больший объем растворителя (1:100, 1:1000 и т.д.);
· добавляют специфический инактиватор – например, пенициллиназу для пенициллина и цефалоспоринов, соответственно от 1000 до 50000-100000 ЕД на 1мл среды;
· добавляют неспецифический инактиватор – например, 4% твин-80, 0,5% соевый лецитин;
· комбинируют способы.
В случае неэффективности вышеописанных методов используют метод мембранной фильтрации.
Определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств методом мембранной фильтрации
Метод мембранной фильтрации может использоваться для контроля микробиологической чистоты не стерильных лекарственных средств, обладающих выраженными антимикробными свойствами, содержащими консерванты, стерильных лекарственных форм, а также сырья и вспомогательных веществ.
Образец лекарственного средства в количестве 10 г (мл) помещают в мерный флакон, растворяют (суспендируют или эмульгируют) в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем был 100 мл.
При испытании растительного лекарственного сырья к образцу в количестве 10 г приливают 100 мл фосфатного буферного раствора рН 7,0, встряхивают в течение 5 минут, а затем для фильтрации используют полученную смывную жидкость.
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах в качестве растворителя может быть использован изопропилмиристат.
Фильтрование проводят в асептических условиях с использованием фильтрационной установки, состоящей из фильтродержателя с мембранным фильтром, соединенным с приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещают мембрану. Для водных, масляных и слабо спиртовых растворов используют нитроцеллюлозные, для сильно спиртовых – ацетатцеллюлозные полимерные мембраны с размером пор 0,45±0,02 мкм, диаметром 47 мм. Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).
Непосредственно после приготовления образец лекарственного средства фильтруют, пропуская по 10 мл раствора через каждую из 6-ти мембран. При испытании лекарственного средства, нерастворимого в воде и образующего суспензию (таблетки, порошки и др.), производят фильтрацию надосадочной жидкости.
Вместе с микробами на фильтре остается противомикробный препарат, поэтому после окончания фильтрации мембраны отмывают 1-5 порциями по 100 мл соответствующего растворителя, например 0,9 % раствором натрия хлорида или, для жирных веществ, растворами, содержащими твин-80. Растворитель не должен подавлять рост микроорганизмов.
После отмывания мембран их извлекают из фильтродержателя и осуществляют следующие операции:
Первые две мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 1 (МПА с 1% глюкозы) в чашки Петри и инкубируют при температуре 32,5 ±2,5°С в течение 5 суток.
Третью и четвертую мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 2 (агар Сабуро) в чашки Петри и инкубируют при температуре 22,5±2,5ºС в течение 5 суток.
Пятую мембрану вносят в 100 мл питательной среды № 3 и инкубируют при температуре 32,5±2,5°С в течение 24-48 часов.
Шестую мембрану вносят в 100 мл питательной среды № 8 и инкубируют при температуре 32,5±2,5°С в течение 24-48 часов.
Для количественного определения бактерий семейства Enterobacteriaceae две мембраны накладывают на поверхность плотной питательной среды № 4 в чашки Петри и инкубируют при температуре 32,5±2,5°С в течение 48 часов.
Количественное определение бактерий и грибов
Посевы на питательных средах № 1 и № 2 просматривают ежедневно, определяя соответственно количество бактерий и грибов. Через 5 суток подсчитывают общее количество бактерий (грибов) на двух мембранах, находят среднее значение, округляют до целого, тем самым, вычисляя общее число в 1 г образца.
Для получения достоверных результатов учитывают только те чашки Петри, в которых на поверхности мембраны отмечен рост до 100 колоний микроорганизмов. Если на поверхности мембраны нет роста, результаты отмечают следующим образом: «В 1 г (мл) лекарственного средства бактерии (грибы) не обнаружены.
Если число колоний на мембране превышает 100, делают ряд дальнейших последовательных разведений образца (1:100, 1:1000 и т.д.)
Для фильтрации выбирают разведение, при котором число колоний на мембране не превышает 100. В этом случае при вычислении числа микроорганизмов в 1 г (мл) среднее значение количества колоний, полученное на двух чашках, умножают на соответствующий коэффициент (10, 100 и т. д.).
Выявление и идентификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus осуществляют по окончании инкубации, как описано для метода прямого посева.
Количественное определение бактерий сем. Enterobacteriaceae (E.coli)
Посевы на питательной среде № 4 просматривают в течение 24-48 часов. При наличии на мембранах роста колоний грамотрицательных палочек, типичных для семейства Enterobacteriaceae, подсчитывают их число на двух мембранах, находят среднее значение, округляют до целого, тем самым вычисляя число бактерий семейства Enterobacteriaceae в 1г образца.
Для количественного определения E.coli в препарате подтверждают рост на среде № 4 (малиновые колонии с металлических блеском или без него, либо розовые или серовато-кремовые в цвет среды диаметром 2-4 мм). Ставят тесты на фермент цитохромоксидазу (отрицательный), утилизацию цитрата натрия (отрицательный) и индол (положительный).
Задания к лабораторному занятию
1. Определите микробиологическую чистоту нестерильных лекарственных средств методом прямого посева (общее количество сапрофитных бактерий и грибов).
2. Определите микробиологическую чистоту не стерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием, методом мембранной фильтрации.
Результаты оценки микробиологической чистоты следует оформлять в виде таблицы 1.
Таблица 1
Микробиологическая чистота лекарственного средства
| Исследуемое лекарственное средство | Разведение | Количество микроорганизмов в 1 г, мл | |||||
| Бактерий | Грибов | Бактерий семейства Enterobacteriaceae | S.aureus | P.aeriginosa | |||
| Дрож-жевых | Плесне-вых | ||||||
Заключение:
Тема: Стерильные лекарственные средства. Понятие о пирогенах. Методы определения стерильности лекарственных средств.
Цель: знать требования, предъявляемые к производству стерильных лекарственных средств; освоить фармакопейные методы определения стерильности.
Вопросы для самоподготовки.
1. Современные требования к производству стерильных лекарственных средств.
2. Пирогены, их природа и свойства.
3. Методы определения стерильности лекарственных средств.
Литература
1. Дикий И.Л., Холупяк И.Ю., Шевелева Н.Е., Стегний М.Ю. Микробиология. – Х.: Прапор, Издательство УкрФА, 1999. – С. 159-165.
2. Н.П.Елинов, Н.А.Заикина, И.П.Соколова. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Медицина, 1988. – С. 87-100.
3. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. / МЗ СССР. – 11-е изд., доп.– М.: Медицина, 1990. – С. 187-193.
В соответствии с рекомендациями Международной федерации фармацевтов и Государственной фармакопеи стерильными должны быть:
· лекарственные средства для парентерального применения (инъекций, инфузий и др. способов введения);
· глазные лекарственные средства (капли, мази, пленки и др.);
· субстанции и вспомогательные вещества, используемые при получении стерильных лекарственных средств, которые не подвергаются стерилизации в процессе производства;
· лекарственные средства для введения в полость тела, где в нормальном состоянии отсутствует микрофлора.
Лекарственные препараты для парентерального введения должны подвергаться контролю не только на стерильность, но и на пирогенность, т.е. отсутствие пирогенов.
Пирогенность (от греч. pyr – огонь, genes – рождающий) – это способность некоторых веществ при парентеральном введении вызывать повышение температуры тела, что сопровождается ознобом, обильным потовыделением, головной болью, тошнотой, учащением пульса. Тяжелые лихорадочные состояния могут иметь летальный исход.
Пирогенные вещества классифицируются как экзогенные (бактериальные) и эндогенные (клеточно-тканевые). Экзогенные пирогены представляют собой продукты жизнедеятельности и распада микроорганизмов. С химической точки зрения – это сложные высокомолекулярные соединения, состоящие в основном из липополисахаридов, адсорбированных на белковом носителе. Эндогенные пирогены – это биологически-активные вещества, выделяемые при определенных условиях белками и лейкоцитами крови (лейкопирогены).
Пирогены объединены рядом общих свойств: имеют малые размеры (от 1 до 50 нм), благодаря чему легко проходят через бактериальные фильтры; водорастворимы, но практически нерастворимы в спирте и ацетоне; чувствительны к действию перекиси водорода, перманганата калия; чрезвычайно термостабильны. Стерилизация сухим воздухом при температуре 160°С в течение 2 ч не гарантирует освобождение стерилизуемого объекта от пирогенов. Нагревание в автоклаве при 120°С приводит к гибели микроорганизмов, но не к разрушению пирогенов. Таким образом весьма понятным становится определение: «стерильный раствор может вызвать пирогенную реакцию», и в этом его опасность. Пирогены отличаются высокой биологической активностью – при выделении всего лишь 1,5 мкт в организм человека массой 75-80 кг вызывают характерную пирогенную реакцию.
Удалить пирогены чрезвычайно сложно и поэтому важное значение имеет соблюдение условий, исключающих возможность микробной контаминации парентеральных растворов и, следовательно, предупреждение пирогенной реакции.
Стерильность лекарственных средств достигается совокупностью противомикробных мероприятий на всех этапах их изготовления, хранения и использования.
На этапе изготовления, в целях предупреждения первичной микробной контаминации, необходимо ограничить содержание микробов в сырье, обеспечить стерильность растворителей, разбавителей, асептические условия технологического процесса. В соответствии с принципами GMP (Good manufacturing practice – надлежащая производственная практика) производство стерильной продукции должно осуществляться в специальных, только для этих целей предназначенных так называемых «чистых» помещениях, в воздухе которых регламентируется строго определенное количество аэрозольных частиц и микроорганизмов. Важное значение имеет соблюдение правил личной гигиены персонала, определенных соответствующими инструкциями.
Испытание на стерильность должно проводится в асептических условиях, в боксах, желательно под вытяжкой стерильного ламинарного потока воздуха, в стерильной антистатической одежде.
Для контроля стерильности готовых лекарственных средств, а также субстанций и вспомогательных веществ, используемых при их изготовлении, используют жидкую тиогликолевую (меркаптоуксусную) среду (для выявления бактерий) и жидкую среду Сабуро (для выявления грибов). При этом используют два метода:
1) метод прямого посева
2) метод мембранной фильтрации.
Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева
Испытуемое лекарственное средство в виде раствора вносят в стерильные колбы (пробирки) со средами в соотношении 1:10 исходя из объема одной контролируемой единицы. При объеме менее 1 мл высевают весь объем; 1-4 мл – 1 мл, 5-19 мл – 2 мл; 20 – 100 мл – 2-4 мл; более 100 мл -10 мл.
Параллельно ставят контроли на нейтрализацию возможного антимикробного действия либо ведением соответствующего инактиватора, либо разведением препарата (см. вышеописанные способы устранения антимикробного действия). Дополнительно ставят контроль роста тест-штаммов без препарата. При этом в среды добавляют по 0,1 мл взвеси суточных тест – штаммов: S.aureus, E.coli, B.subtilis, C.albicans (посевная доза 1000 бактерий).
Посевы инкубируют 14 дней в тиогликолевой среде при температуре 32,5± 2,5°С, в среде Сабуро – при 22,5±2,5°С.
Если после 14-х дневной инкубации в опытных колбах (пробирках) нет микроорганизмов, а в контрольных есть, лекарственное средство считается стерильным.
Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка, других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопией мазков, окрашенных по Граму. При наличии роста микроорганизмов хотя бы в одной опытной пробирке (колбе) препарат считается не стерильным.
При испытании на стерильность мазей или растворов лекарственных средств в маслах в колбу объемом 250 мл, содержащую стеклянные бусы, вносят асептически 0,1 г (мл) образца, 100 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,8-7,0 и эмульгатор твин- 80 в концентрации 2,5 % (в мази на водорастворимой основе эмульгатор не вносят). Содержимое колбы подогревают до 41±1°С, встряхивают до получения однородной эмульсии, после чего вносят в колбу с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл – в колбу с 40 мл среды Сабуро. Дальнейший ход исследования такой же, как при исследовании на стерильность растворов.
Определение стерильности лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ методом мембранной фильтрации
Метод используется в основном для определения стерильности лекарственных средств, обладающих антимикробным действием. По сравнению с прямым посевом метод мембранной фильтрации более надежен и экономичен.
Подготовку образцов и фильтрационной установки осуществляют, как описано в разделе «Определение микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средствах методом мембранной фильтрации».
Растворы (суспензии, эмульсии) пропускают через две мембраны по 10 мл через каждую. После фильтрации мембраны отмывают 3-5 порциями стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9% по 100 мл (при определении стерильности растворов) или растворителя, содержащего твин-80 (при испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах). Затем мембраны извлекают, разрезают стерильными ножницами на две половины – одну помещают в колбу со 100 мл тиогликолевой среды, другую – в колбу со 100 мл среды Сабуро, выдерживают при температуре 32,±2,5°С (тиогликолевая среда) и 22,5±2,5°С (среда Сабуро) в течение 7 суток, ежедневно осуществляя визуальной контроль. При отсутствии роста микроорганизмов считают, что препарат отвечает требованиям на стерильность. В случае роста микроорганизмов опыт повторяют с удвоенным количеством образцов и питательных сред.
Задания к лабораторному занятию
1. Определите стерильность раствора для инъекций, не обладающего антимикробным действием методом прямого посева.
2. Определите стерильность глазных мазей, обладающих антимикробным действием, методом мембранной фильтрации.
Результаты определения стерильности лекарственных средств следует оформить в виде таблицы 2.
Таблица 2
