Лабораторная работа № 15

Микроорганизмы, осуществляющие брожение. Молочнокислые палочки и кокки.

Теоретические пояснения:

Молочнокислые бактерии осуществляют брожение с образованием в качестве основного, а иногда и единственного конечного продукта – молочной кислоты. К ним относятся морфологически разнообразные представители: кокки – Lactococcus (рис. 20), Pediococcus, Leuconostoc; и палочки – Lactobacillus, Bifidobacterium (рис. 20).

Рис.20. Lactococcus (слева) и Bifidobacterium (справа), (Прудникова, 2008)

Основными субстратами для молочнокислого брожения служат моносахара (в первую очередь, глюкоза) и дисахара (мальтоза, лактоза). Брожения других, более сложных субстратов проходят через путь предварительного расщепления их до глюкозы или продуктов ее превращения. Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют только молочную кислоту (не менее 90 %). Катаболизм глюкозы происходит по пути гликолиза до образования пирувата. Пируват служит акцептором электронов. В этом случае при участии ключевого фермента лактатдегидрогеназы 2 электрона переносятся с НАД-H₂ на молекулу пировиноградной кислоты, что приводит к образованию молочной кислоты. Гетероферментативные молочнокислые бактерии расщепляют глюкозу по пентозофосфатному пути. В конечных продуктах присутствуют, помимо молочной кислоты, спирт, уксусная кислота и СО₂. Преобладание в ферментационной среде того или иного продукта зависит от вида культуры, условий культивирования и фазы развития. Типичные представители молочнокислых бактерий объединены в семейство Lactobacillaceae, род Lactobacillus (Рис.21), в составе которого около 50 видов (L. lactis, L. acidophilum, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L. brevis).

Название семейства происходит от латинского слова «лактис» – молоко. Это длинные тонкие палочки, до 10 мкм длиной; иногда кокковидные, в редких случаях подвижные (за счет перитрихальных жгутиков), часто образуют нити. Факультативные анаэробы, иногда микроаэрофилы, слабо растут на воздухе. Хемоорганотрофы, растут только на богатых сложных средах. Метаболизм бродильного типа. Каталазу не образуют. У них отсутствуют цитохромы и другие гемсодержащие ферменты, поэтому синтезировать АТФ за счет дыхания они не могут. Колонии не окрашенные, известково-белого цвета, небольшого размера – 2–5 мм.

Рис. 21. Lactobacillus delbrueckii (электронная микроскопия,) (Прудникова, 2008).

Бактерии могут образовывать внеклеточный полисахарид (декстран или леван). При выделении молочнокислых бактерий на твердой питательной среде в нее добавляют мел. Колонии выросших бактерий окружены зоной просветления в местах растворения мела при взаимодействии его с образующейся молочной кислотой. Оптимальная температура – 30–40 °С. Бактерии отличаются высокой устойчивостью к рН среды и термостабильностью. Благодаря этому они могут расти в кислых средах и при относительно высокой температуре, например в силосе, кислой капусте, бродящем пивном сусле, плодах, овощах, соках, которые подлежат консервированию (L. plantarum). Широко распространены в природе: их можно обнаружить в почве, на разлагающихся остатках животного и растительного происхождения, в молоке и молочных продуктах, пиве, фруктово-винных напитках, солениях, маринадах, пищеварительном тракте человека и теплокровных животных. Сапротрофы (за исключением отдельных видов, играющих определенную роль в кариесе зубов). В ацидофильном молоке в качестве закваски используют чистую культуру L. acidophilum. Болгарская палочка – L. bulgaricus – входит в состав закваски для получения йогуртов. Типовой вид L. delbrueckii используется в биотехнологии для промышленного получения молочной кислоты микробиологическим способом.

Цель работы: изучить морфологию и биохимические свойства молочнокислых бактерий.

Материалы и оборудование: молочнокислые продукты (простокваша, кефир), огуречный и капустный рассолы, микробиологические петли, спиртовки, раствор метиленового синего, пинцеты, микроскопы, пробирки, спиртовки, смесь Никифорова.

Ход работы:

1. Приготовить и просмотреть прижизненный препарат молочнокислых бактерий из сметаны. Для этого на предметное стекло поместить каплю сметаны, распределить ее тонким слоем, добавить смесь Никифорова (1–2 капли). Когда смесь испарится, окрасить препарат метиленовым синим и промикроскопировать.

2. Приготовить и просмотреть прижизненный препарат микрофлоры молочнокислых продуктов (кефир, йогурт) и огуречного рассола.

Streptococcus lactis – овальные кокки, диаметром 0,5-1 мкм, располагаются в культуре попарно (диплококки), цепочками (стрептококки), реже одиночными клетками.

Streptococcus cremoris – клетки расположены более длинными цепочками.

Lactobacterium bulgaricum – болгарская палочка, крупная бактерия, длиной 4-5 мкм, неподвижная, грамположительная, располагается в виде отдельных клеток и коротких цепочек (стрептобактерия). Темепература развития 40-45⁰С.

Lactobacterium acidophilum – ацидофильная палочка, по морфологии близка к болгарской, но имеет другой температурный оптимум развития – 37⁰С.

Lactobacterium cucumeris – огуречная палочка, короткая грамположительная неподвижная бактерия. Располагается парами или цепочкой.

3. Сделать зарисовки.

Вопросы для самоконтроля:

1. Чем отличается гомоферментативное брожение от гетероферментативного?

2. Каковы основные биохимические свойства Lactobacillaceae?

3. Какие типовые виды молочнокислых бактерий используют в промышленности?