Лабораторная работа № 13

Принципы видовой идентификации микроорганизмов. Изучение основных физиолого-биохимических свойств бактерий.

Теоретические пояснения:

Получив чистую культуру (после пересева одной из колоний), необходимо определить, какой вид микроорганизмов она содержит.

При определении вида бактерий пользуются не только морфологическими признаками, но и другими, основанными на поведении бактерий в культурах. Последние в какой-то степени отражают физиологические признаки бактерий. При этом учитывают характер роста на различных питательных средах, образование пигмента, образование или отсутствие пленки на поверхности бульона, степень разжижения желатины и другие признаки. В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль. Они являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения. Каждый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной степени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и восстановление различных субстратов. Стабильность ферментативных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими постоянными признаками для определения видов и типов бактерий. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды.

Сахаролитические свойства микроорганизмов

Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества: СО₂ и Н₂. Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы, другие,наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызывают расщепление и глюкозы, и лактозы. Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также «пестрым» рядом. Короткий «Пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет питательной среды. Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубочк диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности. Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов.

Протеолитические свойства микроорганизмов

Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты. Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов.

Определение индола в культуре микроорганизмов

Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода

Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10-й день после посева.

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов

В культуре микробов могут быть обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма. Как известно, процесс окисления субстрата может происходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидраз. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо одного вещества всегда сопровождается восстановлением (редукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донором, а то вещество, к которому он присоединяется, - акцептором. Акцептором водорода чаще всего является кислород воздуха, однако им могут быть также многие органические соединения, способные легко окисляться и восстанавливаться. С целью выявления ферментов дегидраз и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет. В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индиго-кармин, нейтральный красный и др. Для выявления редуцирующих свойств микроорганизмов указанные красители добавляют к обычным питательным средам: мясопептонному бульону, мясопептонному агару, молоку.

Цель работы: определить вид бактерий

Материалы и оборудование: пробирки с чистой культурой, пробирки со стерильными питательными средами: мясо-пептонным бульоном, мясо-пептонным агаром с прямой поверхностью, мясо-пептонным агаром с косой поверхностью, мясо-пептонной желатиной, молоком, ломтиками картофеля; микробиологические петли и иглы; спиртовка, спички, микроскоп, красители.

Ход работы:

Чистую культуру бактерий (полученную, например, при анализе микрофлоры воздуха) пересевают с соблюдением всех правил микробиологической техники на следующие стерильные питательные среды, находящиеся в пробирках: 1) мясо-пептонный бульон; 2) прямую поверхность мясо-пептонного агара; 3) косую поверхность мясо-пептонного агара; 4) мясо-пептонную желатину; 5) молоко; 6) ломтики картофеля.

В пробирки № 2 и 4 пересев производят иглой уколом, в остальные – петлей, при этом в пробирки № 3 и 6 – штрихом. После посева и этикетирования пробирок их помещают в термостат при температуре 22–25°С, исключая пробирку с мясо-пептонной желатиной, которую оставляют при комнатной температуре (не выше 25°С).

Через несколько дней приступают к определению рода и вида изучаемых бактерий, пользуясь определителем или прилагаемой таблицей, пригодной для определения бактерий из воздушной среды.

Таблица для определения некоторых форм бактерий (сокращенно по Ленису)

А. Определение родов

1. Кокки ………………………………………………….…………………………….2

- Палочки.…..………………………………………………………………..………..3

2. В жидкой среде рост одиночными клетками, двойчатками или неправильными скоплениями………………………………………………. Микрококк (Micrococcus)

- В жидкой среде рост пакетами, напоминающими тюки товаров……………………………………………………………… Сарцина (Sarcina)

- В жидкой среде длинными цепочками……………… Стрептококк (Streptococcus)

3. Бесспоровые формы……………………………………..…... Бактерии (Bacterium)

- Споровые формы………………………………………….………. Бациллы (Bacillus)

Б. Род Микрококк (Micrococcus)

1. На агаре и желатине белый, серый, желтый или оранжевый рост……………....2

- На агаре и желатине рост розовый до ярко-красного……………………….……11

- На агаре и желатине рост синий…………………………….……. M. Cyaneus Cohn

2. Желатина разжижается……………………………..……………………………….3

- Желатина не разжижается……………...…………………….………………………6

3. Молоко свертывается.……………………………………………………………….4

- Молоко не свертывается.……………………………...……………………………...5

4. Рост белый………………………………………….………... M. acidi lacctis Kruger.

- Рост желтый………………………………………………......…..… M. citreus Passet.

- Рост оранжевый……………………………………...….. M. aureus (Rosenb.) Migula.

5. Рост белый……………………………………………………...…... M. butyric Keith.

- Рост желтый…………………………………………………... M. chromoflavus Huss.

- Рост серо-оранжевый………………………………….….... M. Cremoides Zimmerm.

- Рост (буро-желтый)…………………………………….………….. M. Badius L. и N.

6. Молоко свертывается……………………….…………………….…………………7

- Молоко не свертывается…………………………….………….………………..…..8

7. Рост белый................................................................................. M. lactis. acidi Lechm.

- Рост желтый............................................................................... M. lactis. acidi Marpm.

- Рост оранжевый………………………………………..……..... M. umbilicatus Weiss.

8. Рост белый...................................................................................................................9

- Рост иного цвета.........................................................................................................10

9. Подвижные формы............................................................... M. agilis aibus Catterina.

- Неподвижные формы…………………………………………... M. candicans Fliigge.

10. Рост желтый........................................................................ M. sulfureus Zimmerman.

- Рост оранжевый............................................................................. М.aurantiacus Cohn.

- Рост буро-желтый............................................................................... М.versicolor Lbs.

Рост прозрачный, иризирующийся налетами.…...…….. М. concentricus Zimmerman.

11. Подвижные формы…………………………………………….. М. agilis fili Cohen.

- Неподвижные формы…………………………………………... М. roseus L. и N.

В. Род Сарцина (Sarcina)

1. На агаре и желатине белый, серый, желтый или оранжевый рост……………….2

- На агаре и желатине розовый или красный рост…………... Sarcina rosea Schroter.

2. Рост белый или серый……………………..…………….. Sarcina alba Zimermman.

- Рост желтый................................................................................. Sarcina lutea Flugge.

- Рост оранжевый……………………........................…….. Sarcina aurantiaca Flugge.

- Рост буро-желтый……………………………………… ……Sarcina fulva Stubenrath.

Г. Род Стрептококк (Streptococcus)

1. Желатина разжижается………………………………..…………. Str. gracilis L. и N.

- Желатина не разжижается……………………….......……………………………….2

2. Молоко свертывается………………………………………. Str. pyogenes Rosenbah.

- Молоко не свертывается………………………………………….... Str. Kefir Migula.

Д. Род Бактериум (Bacterium)

1. Рост белый до серого, субстрат не окрашивается…………………………………2

- Рост белый до серого, субстрат окрашивается в зелёный, синий или тёмно-бурый цвет……………………………………………………………………………………..7

- Рост жёлтый до ораньжевого………………………………………………………...9

- Рост розовый, красный до буро-красного………………………………………….12

- Рост синий до фиолетового…………………………………………………………13

2. Колонии с ровным, зазубренным или лопастным краем………………………….3

- Колонии с неправильными выростами или лучами……………... B. vulgare L. и N.

3. Неподвижные формыю……………………………………………………………...4

- Подвижные формы……………………………………………………………………6

4. Молоко свёртывается………………………………………………………………..5

- Молоко не свёртывается…………………………………. Bact. Lactis innocuum Lbs.

5. Газообразование на молоке………………………………. Bact. acidi lactici Huppe.

6. Молоко свёртывается, газообразования нет………………...… Bact.coli Escherich.

- Молоко не свёртывается, газообразования нет………………... Bact. Stutzeri L и N.

7. Желатина разжижается, субстрат зеленый…………………. В. fluorescens Flugge.

- Желатина не.разжижается…………………………………………………………...8

- Субстрат окрашивается в синий до черного цвета…………... Васt. Syncyaneum Fl.

- Субстрат окрашивается в синий до черного цвета…...……... Васt. Syncyaneum Fl..

9. Рост ярко-желто-зеленый; очень маленькие палочки, подвижные, медленно разжижающие желатину………………………………………. Васt.turcosum Zimm.

- Рост лимонно- и золотисто-желтый. Палочки неподвижны, желатина не разжижается……………………………………………………… Васt. luteum Flugge.

- Рост желтовато-белый до оранжево-бурого………………..……………………..10

- Рост лимонно-желтый с красным прокрашиванием субстрата.. Васt. Erythorgenes L. и N.

- Рост оранжевый до киргаичио-красного………………………………………….11

10. Желатина не разжижается, неподвижные палочки………………. Bact. crenoides

- Желатина разжижается, подвижные формы………………. Вact. ochraceum Zimm.

11. Неподвижные формы……………………………………….. Васt. fulvum Zimmer.

- Подвижные формы………………………………………….. Васt. chrysogloea Zopp.

12. Желатина не разжижается, неподвижные формы…….…. Васt. latericium L. и N.

- Желатина разжижается,.подвижные формы……………. Вact. prodigiosum Z. и N.

13. Рост фиолетовый…………………………………………. Васt. vioaceum Schroter.

- Рост синий……………………………………………………. Васt. coeruleum L. и N.

Е. Бациллы (Bacillus)

1. Аэробные формы…………………………………………………………………….2

- Строго анаэробные формы…………………………………………………………...8

2. Укол в желатине с боковыми ответвлениями………………………….………….3

- Укол в желатине без ответвлений…………………………………………………...4

3. Ответвления тонкие, длинные, похожие на корневые мочки, слабоподвижный бацилл……………………………………...……………………... Вас. mycoides Flugge.

- Ответвления очень хорошие. Неподвижный бацилл……….…. Вас.tumensces Zopf.

4. Рост на картофеле в виде тонкой, просвечивающей пленки... Вас. oxalaticus Zopf.

- Рост на картофеле в виде белого выпуклого налета…….……...... Вас. subtilis Zopf.

- Рост на картофеле сероватый, плоский, мучнистый…………..... Вас. Subtilis Cohn.

- Рост на картофеле желтовато-бурый………………………………………………...5

- Ростна картофеле с морщинистыми складками……………………………………7

5. Медленно двигающиеся формы……………………….. Вас. megatherium De Bary.

- Быстро двигающиеся формы……………………………………………………...….6

6. На агаре и желатине серый прозрачный рост; очень крупные споры с ребрышками…..………………………………………………... Вас. asterosporus А. М.

- Желтый рост; маленькие палочки с цилиндрическими спорами. Вас. parvus А. М.

7. Рост беловато-серый……………………………. Вас. mesentericus vulgatus Flugge.

- Рост желтоватый…………………………………… Вас. mesentericus fuscus Flugge.

- Рост розовый до розовато-бурого…………………... Вас. mesentericus ruber globig.

- Рост серо-синий до черно-бурого…………………….. Вас. mesentericus niger Lunt.

8. Образования масляной кислоты нет; энергичное разложение белков; спорообразование плектридиальное…………………..………………………….. Вас. putrificus Bienstov.

- Масляная кислота образуется, белки не разлагаются, спорообразование клостридиалъное………………………………………………………………………………9

9. Подвижные формы………………………………..… Вс. amylobacter mobilis А. М.

- Неподвижные формы…………………………….. Вас. amylobacter immobilis А. М.

Вопросы для самоконтроля:

1. В чем заключаются окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов?

2. Что означает «пестрый ряд Гисса»?

3. Как определяют протеолитические свойства микроорганизмов?

4. В результате каких биохимических процессов микроорганизмы образуют индол и сероводород?