Для калибровки коагуляционных тестов

Для калибровки исследования активности и большинства концентрацион­ных исследований используется пул цитратных плазм:

• Нормальная плазма (100% значения) - пул цитратных бестромбоцитных плазм, полученный по крайней мере от 20 клинически здоровых доноров, исследованных на отсутствие нарушений гемостаза. Эти плазмы смешива­ются между собой, разливаются по аликвотам и замораживаются при тем­пературе -70 С. В этой сливной плазме (называемой нормальной) актив­ность всех факторов свертывания считается по определению как 100% или 3-Ед/мл. Нормальная плазма и ее серийные разведения используются для многоточечной калибровки. Лиофилизованная нормальная плазма должна быть калибрована производителем против свежей или свежезаморожен­ной нормальной плазмы.

• Референтная плазма (100% значения) - централизованно приготовленная нормальная плазма, критерии и процедура приготовления которой опреде­лены в стандарте DIN58939-1.

• Калибровочная плазма (значения часто отличаются от 100%, но точно оп­ределены) - калибровочная плазма представляет собой пул цитратных плазм, в котором активность или концентрация компонентов гемостаза точ­но определена по сравнению с соответсвующими материалами (нормаль­ной плазмой, референтной плазмой). Калибровочная плазма и ее серийные разведения используются для многоточечной калибровки с учетом активно­сти или концентрации определенной производителем. Для некоторых тестов существует набор калибровочных плазм с различной концентрацией или ак­тивностью, что позволяет выполнять многоточечную калибровку без серий­ных разведении.

Как КАЛИБРУЮТСЯ КОАГУЛЯЦИОННЫЕ ТЕСТЫ?

• Калибровка с использованием серийных разведении выполняется с ис­пользованием нормальной, референтной или калибровочной плазмы (стан­дарт DIN 58911-1). Количество необходимых точек зависит от формы калибровочной кривой. По крайней мере 3-6 точек калибровки должны покрывать исследуемый диапазон.

• Калибровка с использованием калибровочных плазм с разным уровнем зна­чений - может быть выполнена с использованием 3 или более калибро­вочных плазм с различным уровнем значений. Неиспользование серийных разведении предотвращает общее разведение факторов свертывания, включая фибриноген (важно для определения протромбинового времени).

Математическая связь между активностью (концентрацией) фактора и временем свертывания выражается в форме калибровочной кривой. Время свертывания пациента с использованием калибровочной кривой может быть трансформировано в единицы активности или концентрации соответствую­щего фактора.

• Калибровочные кривые - при построении калибровочной кривой взаимо­связь между клоттинговым временем и активностью / концентрацией фак­тора, как правило, нелинейна. Таким образом, график представляет собой не прямую, но кривую линию. В случае линейного представления калибро­вочной кривой используются различные системы координат, например об­ратная - для протромбинового времени, или полулогарифмическая — для исследований отдельных факторов.

• Факторы калибровки - в случае существования пропорциональной зависи­мости вместо использования калибровочной кривой может быть использован фактор калибровки. Это применимо, например, для исследования анти­тромбина III с использованием хромогенных субстратов, где существует пропорциональная зависимость между активностью в %% и оптической плотностью

• Калибровочные таблицы - после построения калибровочной кривой взаимосвязь между клоттинговым временем и активностью / концентрацией мо­жет быть представлена в форме таблиц. Эти таблицы имеют то преимуще­ство, что данные могут быть считаны непосредственно с таблицы путем ин­терполяции результатов на существующие в таблице парные значения.

• Математические уравнения - в определенном диапазоне калибровочная кривая может быть представлена в форме математической функции, позволя­ющей рассчитать активность / концентрацию из клоттингового времени.

Калибровочные кривые или другие формы калибровки могут использо­ваться для расчета так долго, как долго сохраняются неизменные аналитические условия (реагенты, серии реагентов, приборы, процедура анализа). Для избежания случайных влияний и подтверждения действенности калибровки обязательно выполнение контроля качества.

3.30. какие КАЛИБРАТОРЫ И КОНТРОЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ПОСТАВЛЯЕТ рош?

Калибровочные плазмы и стандатры

Название продукта	Для калибровки
Unicalibrator	пв Фибриноген Факторы свертывания (11, V, VII. X. VIII. IX, XI, XII)Протеин С Протеин S Антитромбин III Плазминоген a2-антиплазмин
Precimat Chromogen	Антитромбин III Плазминоген Протеин С хромогенный Фибриноген (кинетическим методом)
LIAtest calibrator	фактор Виллебранда
Fibrmogen Standard	Fibnnogen A
Hepanorm H	Нефракционированный гепарин
Hepanorm H HBPM/LMWH	Низкомолекулярные фракции гепарина

Контрольные плазмы

Название продукта	Для контроля
PreciClot I (нормальный уровень значений)	пв, АПТВ, Тромбиновое время Рептилазное время Факторы свертывания (11. V, VII, X, VIII, IX, XI, XII) Протеин С Протеин S Антитромбин III Плазминоген a2-антиплазмин
Preciclot 11 (патологический уровень зн)	Те же параметры, что и PreciClot I
Preciclot III (патологический уровень зн)	ПВ, АПТВ
PreciChrom I/II	Антитромбин III Плазминоген Протеин С хромогенный Фибриноген (кинетическим методом)
LIAtest control	Д-Димер фактор Виллебранда
Heparin control	Нефракционированный гепарин,
HBPM/LMWH control	Низкомолекулярные фракции гепарина

3.31. ЧТО ТАКОЕ СКРИНИНГОВЫЕ ТЕСТЫ И "ГРУППОВЫЕ ТЕСТЫ"?

Скрининговыми тестами являются коагуляционные исследования, предос­тавляю­щие информацию об определенных фазах гемостаза, т.е. не об актив­ности / концент­рации отдельных компонентов, а о функционировании опре­деленных частей коагуля­ционного каскада в целом.

Согласно определению, использовавшемуся в прошлом, скрининговые те­сты имели следующие характеристики:

• Они обнаруживали общее нарушение гемостаза, но не указывали на приро­ду этого нарушения

• Тесты выявляли, по преимуществу, нарушения системы плазменной коагуля­ции, реже - функции тромбоцитов или фибринолитической системы

• тесты являлись не чувствительными и, таким образом, были патологически­ми только в случае выраженного нарушения

• Скрининговые тесты включали в себя следующие параметры:

* время свертывания (ВС)

* активированное время свертывания (АВС) '* тест на толерантность к гепарину (ГТТ)

* тест на толерантность к гирудину

* время рекальцификации (ВР)

* активированное время рекальцификации (АВР)

* каолиное время свертывания (КВС)

* тромбоэластограмма (ТЭГ)

* время кровотечения

* фибринолитическая активность

* эуглобулиновый тест

Эти тесты (ВС, АВС, ГТТ, ВР, АВР, КВС) определяли следующие компоненты:

Все эти тесты в состоянии выявлять только серьезные нарушения гемостаза. На тесты, использующие цельую кровь (ВС, АВС) или цитратную кровь (ГТТ, АВР, ВР), дополнительно влияют тромбоциты пациента.

Многие методы, описанные в прошлом как скрининговые, потеряли свое

значение благодаря развитию специфических исследований. Большинство скрининговых ранее тестов в настоящее время используются редко.

Согласно определению, использовавшемуся в прошлом, групповые тесты имеют следующие характеристики:

• Они указывают область нарушения гемостаза

• Они определяют нарушения плазменной коагуляции или фибринолиза

• Они являются более чувствительными, чем скрининговые тесты и, таким об­разом, выявляют менее грубые нарушения гемостаза.

• Групповые тесты включают в себя:

* протромбиновое время

* АПТВ

* тромбиновое время

* рептилазное время

В настоящее время не используется термин "групповые тесты". Тем не менее, методы остаются действенными, и эти тесты приобрели характер и на­звание скрининговых.

3.32. ЧТО ПОДРАЗУМЕВАЕТСЯ ПОД "ВРЕМЕНЕМ КРОВОТЕЧЕНИЯ"?

Время кровотечения это время между выполнением небольшого проко­ла кожи и прекращением кровотечения.

Для определения времени кровотечения по методу Дюка скарификатором выполняется прокол мочки уха на глубину 3 мм Включается секундомер, а вы­текающая кровь собирается с интервалом 15 сек. на фильтровальную бумагу до тех пор, пока не прекратится кровотечение. Регистрируется время прекра­щения кровотечения. Нормальное время кровотечения, определяемое таким методом, составляет 120-240 сек.

Существует также множество других методов определения времени кро­вотечения (методы Шульца, Маркса, Иви и т.д).

Увеличенное время кровотечения может быть ассоциировано со следую­щими состояниями:

1 Нарушения функции тромбоцитов - время кровотечения выявляет не все возможные нарушения функции тромбоцитов (такого теста просто не суще­ствует!), а только нарушения адгезии и, в некоторой степени, агрегации. Такие расстройства имеют место при наследственной или приобретенной патологии тромбоцитов, а также при болезни Виллебранда. В последнем случае время кровотечения удлинено не всегда, что зависит от типа забо­левания и текущего статуса гемостаза. При гемофилии время кровотече­ния нормально, несмотря на термин гемофилия Так как при гемофилии нет нарушений функции тромбоцитов, образование тромбоцитарной проб­ки в области небольшой ранки развивается также, как и в норме, и доста­точно для остановки кровотечения.

2 Тромбопения при количестве тромбоцитов менее чем 50х106/л время кровотечения может быть увеличено. К сожалению, невозможно опреде­лить точную границу, так на время кровотечения оказывают влияние мно­жество других факторов функциональной активности тромбоцитов.

3. Нарушения в капиллярах повреждения капилляров, по преимуществу токсической природы, могут также вести к увеличению времени сверты­вания

4. В ысокая концентрация гепарина

Данный тест имеет значение как часть общего скринингового профиля, в особенности при предоперационном скрининге и у детей.

3.33. какая ИНФОРМАЦИЯ В ПРИНЦИПЕ МОЖЕТ БЫТЬ ПОЛУЧЕНА ПРИ СКРИНИНГЕ ПО ПРОТРОМБИНОВОМУ ВРЕМЕНИ, АПТВ И ТРОМБИНОВОМУ ВРЕМЕНИ?

Скрининговые методы (ПВ, АПТВ и ТВ) являются базисными при диагностике нарушений свертывания.

Первичными данными, получаемыми из этих тестов, являются секунды. В случае ПВ эти результаты конвертируются в другие единицы (3.36). Эти тесты разработаны и применяются для выявлений фактор-связанных нарушений в процессе свертывания, т.е. нарушений факторов внешнего и внутреннего пути активации, а также фибриногена. Тесты выявляют нарушения следующих фаз коагуляционного процесса:

ПВ: внешний путь активации свертывания;

АПТВ: внутренний путь активации свертывания;

ТВ: образование фибрина из фибриногена.

Для оценки пациентных плазм необходимо знать "нормальные" величины, опреде­ля­емые по плазмам клинически здоровых доноров.

Патологические результаты проявляются в виде "укорочения" или "удлинения" клоттингового времени.

Укороченные" значения указывают на состояние "гиперкоагуляции", и в большинстве случаев не имеют клинического значения.

Удлиненные" значения указывают на состояние гипокоагуляции, выявле-ние которой является основной задачей скрининговых тестов. Кроме фактор связанных нарушений, три клинически значимых процесса могут вести к удлинению всех трех скрининговых тестов:

• гепаринотерапия

• присутствие в пробе продуктов деградации фибрина / фибриногена

• присутствие в пробе патологических ингибиторов.

Выполнение ПВ, АПТВ и ТВ в качестве скрининговых тестов имеет смысл по следующим причинам' комбинация их результатов делает возможным решить, какой тест нужно выполнять для уточнения нарушения (например факторы, ингибиторы). Однако, нужно иметь в виду, что чувствительность этих тестов к гепарину, продуктам деградации фибрина/фибриногена и патологическим ингибиторам варьирует. Но эта разница в чувствительности имеет мес то не между этими тремя тестами, а в пределах одного и того же теста при использовании различных реагентов и техники выполнения.

3.34. какие КОМПОНЕНТЫ ГЕМОСТАЗА ИЗМЕРЯЮТСЯ

ПРИ ПОМОЩИ ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ?

При помощи протромбинового теста определяется время, требуемое для образования сгустка после добавления в плазму тканевого тромбопластина

(тканевого фактора) и кальция. Тканевой тромбопластин, используемый для старта реакции, представляет собой водный экстракт липопротеинов из некоторых тканей млекопитающих и укорачивает в присутствии ионов кальция время свертывания крови или плазмы.

С помощью протромбинового времени определяется активность факторов свертывания внешнего пути активации:

РИСУНОК

Возможными причинами патологически удлиненного протромбинового вре­мени пациента (или снижения, выраженных в процентах результатов) являются:

• снижение активности факторов свертывания внешнего пути активации;

• наличие гепарина в пробе;

• наличие в пробе продуктов деградации фибрина / фибриногена;

• наличие в пробе патологических ингибиторов.

Наследственное снижение активности факторов внешнего пути активации свертывания:

Протоомбиновое время с двумя различными тромбокиназами (ТК) иотдельныефакторы у четырех пациентов с наследственным дефицитом Vll фактора:

ПВ (%%)	Отдельные факторы (%%)
Пациент	TK1	ТК2		V	VII	X

В случае крайне редкого наследственного дефицита факторов, обычно по­врежден только один фактор. Снижение протромбинового времени (в %%) от­ражает степень снижения активности этого фактора, в данного случае VII.

Приобретенное снижение активности факторов внешнего пути активации свертывания

Часто встречающееся приобретенное снижение активности факторов свертывания внешнего пути активации вызывается:

• лекарствами (особенно антагонистами витамина К);

• заболеваниями печени;

• дефицитом витамина К;

• коагулопатиями потребления.

В этом случае повреждается, как правило, несколько факторов одновре­менно.

Основными показаниями для определения протромбинового времени яв­ляются:

• мониторинг терапии оральными антикоагулянтами;

• оценка синтетической функции печени;

Протромбиновое время с двумя различимыми тромбокиназами ПК) и отдельные факторы у четырех пациентов с прибоетенным дефицитом факторов:

	ПВ(%%)	Отдельные факторы (%%)	Причина
Пациент	TK1	ТК2		V	VII	X
							Терапия кумарином
							Заболевания печени

У пациентов 1 и 2 снижена активность II, VII и X, но не V факторов. Такое состояние типично для терапии оральными антикоагулянтами или дефицита витамина К. В случае снижения синтетической функции печени (например, цирроза печени), типично обнаружение сниженной активности всех факторов.

Обе таблицы демонстрируют тот факт, что при использовании различных тром­бо­пластинов одна и та же плазма дает разные результаты. Причина этогo заключается в том, что коммерческие тромбопластины реагируют с разной чувствительностью на снижение активности факторов внешнего пути активации (II, V, VII, X). При тести­ровании одной и той же плазмы с разными тромбопластинами, один тест может пока­зывать удлинение протромбинового вре­мени, в то воемя как другой может оставаться в нормальном диапазоне зна-

чений. При выраженном снижении активности факторов, такая разница ме­жду различными тромбопластинами наиболее заметна.

До сих пор ло конца не выяснены причины различной чувствительности тромбопластинов к дефициту факторов. Может играть роль разница в проис­хождении или факторы, ассоциированные с производством (контаминация чужеродными белками). Относительно протромбинового времени, как теста нужно учитывать активность контаминирующих факторов и ингибирование реакции PIVKA (акарбоксилированными) формами факторов свертывания.

Дефицит фибриногена (I фактор) крайне редко является причиной для уд­линения протромбинового времени, и оказывает такое влияние только в случае резкого снижения концентрации, менее чем 0.3 г/л.

3.35. почему ОТЛИЧАЕТСЯ ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ, ОПРЕДЕЛЯЕМОЕ В РАЗНЫХ ЛАБОРАТОРИЯХ?

Основной проблемой является отсутствие стандартизации теста, хотя для этого были сделаны многочисленные попытки. Разница означает, что крайне трудно сравнить результаты, полученные в различных лабораториях. Особен­но это важно для мониторинга лечения оральными антикоагулянтами, кото­рый сейчас широко проводится.

За разные результаты ответственны методические факторы, которые мо­гут быть разделены на 4 основных комплекса: реагенты, метод детекции, тех­ника выполнения и оценка.

1. Реагенты

• Тип используемого тромбопластина:

- полученный из разных органов (мозг, легкие, плацента);

- полученный из разных видов животных (кролики, обезьяны, быки, человек);

- рекомбинантного производства.

• Тип добавок в реагент:

- добавление факторов свертывания (V, I);

- добавление антагонистов гепарина.

2. Метод детекиии по конечной точке

• Мануальная:

- метод покачивания (переворачивания) пробирки;

- метод крючка.

• Автоматическая:

- электромеханическая (металлический шарик);

- оптическая (турбидиметрия):

- сухая химия (подвижность эритроцитов);

- хромогенные субстраты.

3. Техника выполнения

• использование различных исследуемых образцов:

- плазма;

- капиллярная кровь;

- разведенный образец.

• Калибровка различными материалами:

- пул нормальных плазм (свежая, замороженная, лиофилиз|ованная);

- дилюенты (раствор NaCI, буфер для разведения);

- калибровочная плазма с определнной активностью.

- Несовпадение в выполнении реакции:

- отношение образец — реагент;

- концентрация хлорида кальция.

4. Оценка результатов:

- клоттинговое время в секундах;

- проценты от нормы;

- отношение (протромбиновый индекс);

- Международное Нормализованное Отношение (MHO).

3.36. как МОЖЕТ БЫТЬ ВЫРАЖЕН РЕЗУЛЬТАТ ПРОТРОМБИИОВОГО

ВРЕМЕНИ?

Первичным результатом, получаемым для протромбинового времени, является клоттинговое время, выраженное в секундах. Учитывая большое раз­нообразие в процедурах выполнения, такой результат является мало пригод­ным для оценки. В настоящее время существуют три различных способа вы­ражения результата:

• протромбиновое время в процентах;

• отношение (протромбиновый индекс);

• Международное нормализованное отношение (MHO).

Протромбиновое время в процентах

В большинстве стран континентальной Европы протромбиновое время вы­ражается в процентах от нормы. Калибровка выполняется с использованием нормальных или калибровочных плазм. Результаты калибровки представляют­ся различными способами, чаще в форме графика в полуобратных координа­тах. Калибровочная кривая используется для пересчета клоттингового време­ни пациента в проценты от нормы.

Отношение (протромбиновый индекс)

Протромбиновый индекс определяется следующим способом:

ПИ = протромбиновое время образца / протромбиновое время нормаль­ной плазмы.

Для калибровки необходимо пользоваться только нормальной 100% плаз­мой.

Международное Нормализованное Отношение (МНР)

MHO определяется как протромбиновый индекс, полученный при исполь­зовании тромбопластина, приготовленного в соответствии с международны­ми референтными стандартами. Для расчета MHO с используемым в практи­ке тромбопластином, необходимо знать его международный индекс чувстви­тельности (International sensitivity Index, ISI). MHO рассчитывается по следую­щей формуле: