Занятие №11

Тема. Нарушения системы эритроцитов.

Цель занятия. Изучить причины, механизм развития, гематологические показатели и клинические проявления различных видов анемий.

Теоретические вопросы:

1. Эритроцитозы, определение понятия, виды, клинические проявления.

2. Характеристика абсолютных и относительных, наследственных и приобретенных эритроцитозов, их этиология и патогенез.

3. Анемии, определение, принципы классификации (по этиологии, патогенезу, типу кроветворения, цветовому показателю, регенераторной способности костного мозга, размеру и форме эритроцитов).

4. Острая постгеморрагическая анемия, этиология, патогенез, стадии, гематологические проявления.

5. Гемолитическая анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

6. Железодефицитная анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

7. В-12-(фолиево)-дефицитная анемия, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

8. Гипо- и апластические анемии, причины, механизмы развития, гематологические проявления.

9. Клинические проявления и компенсаторно-приспособительные механизмы при анемиях.

10. Принципы диагностики и лечения анемий.

11. Осмотическая резистентность эритроцитов, определение понятия, виды.

12. Причины и механизм нарушения осмотической резистентности и скорости оседания эритроцитов, их диагностическое значение.

Работа №1. Характеристика показателей красной крови при экспериментальной гемолитической анемии.

Материальное оснащение:

1.Пробирки простые	- 5 шт.
2. Штатив на 5 гнезд	- 2 шт.
3. Пипетки на 0,02мл	- 4 шт.
4. Пипетки на 5мл	- 4 шт.
5. Иглы от шприца для прокола вены	- 2 шт.
6. Стеклянная палочка в стакане	- 2 шт.
7. Стакан с ватой	- 2 шт.
8. Обезжиренные предметные стекла	- 4 шт.
9. Стекло со шлифованными гранями	- 2 шт.
10. Ванночка для окраски мазков со стеклянными рельсами	- 2 шт.
11. Полоски фильтровальной бумаги	- 20 шт.
12. Чашки Петри, выстланные влажной фильтровальной бумагой	- 2 шт.
13. Счетная камера и шлифованное покровное стекло к ней	- 2 шт.
14. Микроскопы	- 4 шт.
15. Фотоэлектроколориметр	- 1 шт.
16. Этиловый спирт (960)	- 20 мл
17. Трансформирующий раствор (ацетонциангидрин – 0,5мг; калий железосинеродистый – 0,2г; натрия гидрокарбонат – 1г; дистиллированная вода – до 1л)	- 20 мл - 20 мл
18. Калибровочный раствор гемиглобинцианида (61,23 мг/100 мл)	- 10 мл
19. 1% раствор хлорида натрия	- 20 мл
20. Смесь Никифорова (960 этиловый спирт и этиловый эфир в соотношен 1:1)	- 100 мл
21. Насыщенный раствор бриллианткрезолбладу в абсолютном спирте (краска – 1,2г; абсолютный спирт – до 100 мл)	- 10 мл
22. Животные: кролик с гемолитической анемией	1 шт.

Методика проведения опыта.

Гемолитическая анемия у кролика воспроизводится путем подкожного введения 1% раствора фенилгидразина солянокислого (5мг/кг) трехкратно в течение 6 дней (с двухдневным интервалом).

В день занятия из краевой вены кролика (после прокола) набирают 0,02 мл крови в пробирку с заранее налитым трансформирующим раствором в количестве 5 мл, при этом кровь разводится в 251 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, оставляют стоять на 10 мин, а затем фотометрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 560нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор).

При тех же условиях обрабатывают и измеряют стандартный раствор с концентрацией гемоглобинцианида – 61,23 мг/100мл, что соответствует количеству гемоглобина в крови, равному 15,4 г/100мл при разведении ее в 251 раз.

Концентрация гемоглобина в крови (Гб, г%) вычисляется по формуле:

Гб = (Еоп/Ест) · С · К · 0,001, где

Еоп – экстинция опытной пробы;

Ест – экстинция стандартного раствора;

С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%;

К – кратность разведения крови;

0,001 – коэффециент для пересчета мг/100 в г/100мл.

Одновременно берут 0,02мл крови в пробирку, в которую предварительно наливают 4 мл 1% раствора хлорида натрия (кровь разводится в 200 раз). Содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета.

Счетную камеру подготавливают следующим образом. Камеру с сеткой и покровное стекло насухо протирают. Затем покровное стекло прижимают к камере с такой силой, чтобы по краям его появились радужные полосы.

Перед заполнением счетной камеры разведенной кровью содержимое пробирки встряхивают. Затем стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно заполнила всю поверхность камеры с сеткой.

Эритроциты подсчитывают под малым увеличением (окуляр-7^х, объектив-8^х) в 5 больших (80 малых) квадратах сетки Горяева и вычисляют по формуле:

Эр=(А · С · 4000)/В, где

Эр - искомое число эритроцитов;

А – сумма клеток, подсчитанных в малых квадратах сетки;

В – количество сосчитанных малых квадратов (80);

С – разведение крови (в 200 раз)

4000 – множитель, приравнивающий объем малого квадрата (1/4000 мм³) к 1 мм³.

Для характеристики степени насыщаемости гемоглобином отдельного эритроцита определяют так называемый цветовой показатель (ЦП) по следующей формуле:

ЦП=(Гб · 3)/Эр, где

Гб – концентрация гемоглобина (в г%);

Эр – первые две цифры (сотни тысяч) эритроцитов;

3 – постоянный коэффициент.

Параллельно оценивают количество ретикулоцитов в крови. Для этого на предварительно окрашенное краской (бриллиант-крезолблау) предметное стекло помещают каплю исследуемой крови и делают мазок обычным способом. Препарат помещают во влажную камеру на 8-10 минут, затем высушивают его и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа (окуляр-15^х, объектив – 90^х).

Подсчитывают 1000 эритроцитов и определяют среди них процентное содержание ретикулоцитов (ретикулоциты отличаются от окрашенных в зеленый цвет эритроцитов наличием в цитоплазме синих зерен или сетки). Для облегчения подсчета эритроцитов из бумаги вырезают кружок, соответствующий диаметру окуляра микроскопа. В центре кружка проделывают небольшое четырехстороннее отверстие и вставляют в оптическую систему окуляра.

Работа №2. Изучение показателей красной крови при экспериментальной постгеморрагической анемии.

Материальное оснащение:

1.Животные: кролик с постгеморрагической анемией - 1 шт.

Остальное см. в работе №1.

Методика проведения опыта:

У кролика за 2 дня до занятия выпускают 40-50% крови, вследствие чего развивается острая постгеморрагическая анемия.

В день занятий в крови, взятой из краевой вены, определяют концентрацию гемоглобина, подсчитывают число эритроцитов и ретикулоцитов, вычисляют цветовой показатель (способы оценки указанных параметров крови см. в работе №1).

Результаты, полученные в работах 1 и 2, сопоставляют и анализируют. В заключении обсуждают механизмы развития постгеморрагической и гемолитической анемий.

Работа №3. Характеристика клеточного состава крови больных с различными видами анемий.

Материальное оснащение.

1.Мазки крови больных:

с постгеморрагической анемией - 2 шт.

с гемолитической анемией - 2 шт.

с В₁₂ – дефицитной анемией - 2 шт.

2.Микроскоп - 1 шт.

3.Иммерсионное масло в масленке - 10 мл.

Ход анализа.

Под иммерсионной системой микроскопа (окуляр – 15^х, объектив – 90^х) изучают готовые мазки крови больных с указанными анемиями. Обращают внимание на патологические формы эритроцитов (анизо-, пойкилоцитоз; мегалобластический тип гемопоэза и др.). Обнаруженные в мазках крови измененные эритроциты зарисовывают в тетрадях. Делают выводы по проделанной работе.

Работа № 4. Оценка осмотической резистентности эритроцитов при постгеморрагической и гемолитической анемиях у кроликов.

Материальное оснащение:

1.Пробирки простые - 27 шт.

2.Штативы на 10 гнезд - 3 шт.

3.Пипетки на 1 мл. - 3 шт.

4.Пипетки на 2 мл. - 6 шт.

5.Игла от шприца для прокола вены - 3 шт.

6.Центрифуга лабораторная - 1 шт.

7.1% раствор хлорида натрия - 50 мл.

8.Дистиллированная вода - 50 мл.

9.Гепарин - 1 мл.

10. Животные: кролик с постгеморрагической

анемией - 1 шт.

кролик с гемолитической анемией - 1 шт.

кролик контрольный - 1 шт.

Методика проведения опыта.

Способы моделирования постгеморрагической и гемолитической анемий см. в работах 1 и 2.

В день занятия из краевой вены кролика после прокола иглой берут 2-3 мл крови с двумя каплями гепарина. Содержимое пробирки сразу же перемешивают для предотвращения образования сгустков крови и центрифугируют 10 минут при 2000 об/мин. Для анализа используют эритроцитарную массу.

Из 1 % раствора хлорида натрия готовят ряд разведений (табл.1).

Таблица 1

№ пробирок
1% р-р NaCI, в мл.	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,9	0,8	0,6	0,5
Дист. вода, в мл.	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,1	1,2	1,4	1,5
Конц. р-ра NaCI,в%	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,45	0,4	0,3	0,25
Взвесь эритроцитов	П о д в е к а п л и
Результаты

Максимальная осмотическая резистентность эритроцитов определяется в той первой пробирке, в которой наблюдается полный гемолиз. Минимальная осмотическая резистентность эритроцитов регистрируется после центрифугирования пробирки (при 1000 об/мин. в течение 5 минут), содержащей супернатант со следами гемолиза (розовый оттенок надосадочной жидкости).

В норме:

минимальная осмотическая резистентность эритроцитов – 0,46- 0,48% раствор хлорида натрия;

максимальная осмотическая резистентность эритроцитов – 0,28 -0,32 % раствор хлорида натрия.

В данной работе исследуют кровь опытных и контрольного кроликов. Полученные результаты сопоставляют и анализируют.

В заключении обсуждают возможные механизмы нарушения физико-химических свойств эритроцитов при изученных анемиях.

Работа № 5. Характеристика скорости оседания эритроцитов при развитии острого воспалительного процесса.

Материальное оснащение.

1.Капилляр Панченкова - 5 шт.

2.Штатив Панченкова - 1 шт.

3.Лезвие для безопасной бритвы - 1 шт.

4.Часовое стекло - 1 шт.

5.Стеклянная палочка в стакане - 1 шт.

6.Стакан с ватой - 1 шт.

7.5% раствор трехзамещенного цитрата натрия - 10 мл.

8.Этиловый спирт (96⁰) - 10 мл.

9.Животные: крысы с воспалительной реакцией - 2 шт.

крыса интактная - 1 шт.

Методика проведения опыта.

Эксперимент ставят на двух крысах. За двое суток до занятия одной из них вводят в брюшную полость 7- 8 мл стерильного мясопептонного бульона, а другой - подкожно 0,5 мл скипидара. В обоих случаях развивается регионарное асептическое воспаление.

На занятии у опытной и контрольной (интактной) крыс определяют скорость оседания эритроцитов. Для этого капилляр Панченкова промывают раствором цитрата натрия. Затем цитрат натрия набирают до метки “P” (¼ полного объема капилляра) и вдувают его на часовое стекло.

После надреза боковой поверхности корня хвоста животного в капилляр Панченкова набирают кровь до метки “K” (полный объем капилляра). Кровь переносят на часовое стекло и тщательно перемешивают его с цитратом стеклянной палочкой. В результате получается разведение крови в цитрате в соотношении 4:1. Затем цитратную кровь набирают в капилляр до метки “K” и ставят в штатив Панченкова. Через 1 час регистрируют СОЭ по высоте отстоявшегося слоя плазмы в мм (мм/ч).

Результаты опытов сопоставляют с контролем. В заключении обсуждают вероятные механизмы изменения СОЭ при воспалительной реакции.

Работа №6. Решение ситуационных задач по теме.