Характеристика возбудителя

Лекция №

Инфекционная бурсальная болезнь кур.

План.

1. Характеристика возбудителя болезни

2. Эпизоотологические особенности

3. Диагностика

4. Иммунитет и специфическая профилактика

Семейство: Birnaviridae.

Таксономическая структура семейства.

Семейство: Birnaviridae

Род: Aquabirnavirus, Avibirnavirus, Entomobirnavirus.

Характеристика вириона. Морфология. Вирион безоболочечный, икосаэдральной симметрии (диаметр 60 нм) с одним протеиновым чехлом. Капсид образован 260 тримерными субединицами (решетка Т13), внутренний слой состоит из 200 тримерных субъединиц, производных VP3 и VP4 по внутренним пятиосным вершинам. Mr (вирион) 55х10⁶, плавучая плотность в CsCl 1,33 г/см³ (1,30 г/см³ – дефектные интерферирующие частицы), S_20w 435S.

Вирусные частицы стабильны при рН 3-9, нагревании до 60 ^оС в течение 1 часа, устойчивы к эфиру и 1%-го додецилсульфата натрия при 20 ^оС, рН 7,5 в течение 30 минут.

Геном. Геном представлен 2 сегментами двуспиральной РНК (9-10% массы вириона). Размер большего сегмента А вируса инфекционного некроза поджелудочной железы рыб (IPNV) варьирует в пределах 2962 bp (штамм SP), 3092 bp (штамм Jasper) и 3104 bp (штаммы N1 и DRT). Размер сегмента В варьирует от 2731 bp (штамм DRT) до 2784 bp (штамм Jasper). У вируса инфекционной бурсальной болезни (IBDV) размер сегмента А составляет от 3063 bp (штамм Farragher) до 3261 bp (штамм Р2). Сегмент В данного вируса имеет размер от 2715 bp (штамм UK661) до 2922 bp (штамм QC-2). У Drosophila X virus (DXV) сегмент А имеет длину 3360 bp. Несмотря на различия в размере сегмента А среди членов одного рода, продуктом кодирующего участка генома является полипротеин из 972 (IPNV), 1012 (IBDV) и 1032 (DXV) аминокислотных остатков. Также репортерный участок кодирует вирусную полимеразу размером 844-845 (IPNV), 879 (IBDV) и 891 (штамм QC-2, IBDV) аминокислотных остатков. Оба геномных сегмента включают протеин VPg (Mr 94x10³), связанный с ним по 5’-концам.

Другие компоненты вириона. Вирион содержит 5 полипептидов: VP1 (Mr 94x10³), обладающий активностью РНК-зависимой РНК полимеразы, так же как и VPg; пре-VP2 (Mr 62x10³) и VP2 (Mr 54x10³), являющиеся мажерными капсидными полипептидами и типоспецифическими антигенами; VP3 (Mr 30x10³), являющийся внутренним капсидным протеином и группоспецифическим антигеном. Неструктурный протеин NS (IPNV) является вирускодируемой протеазой, которая разрезает полипротеин до VP2, NS и VP3. Вирусный протеин, обозначаемый VP4 (Mr 29x10³), является компонентом вириона IBDV и проявляет протеазную активность, как и протеин NS. Дополнительный неструктурный полипептид (имеющий положительный заряд), обозначаемый VP5 (Mr 16,5x10³ у IBDV или 17x10³ у IPNV) не существенен для репликации вируса IBDV. Нет сведений о 5’-кэпировании вирусных мРНК. Липидов в структуре вириона не обнаружено. У IPNV и IBDV N-гликозилированных протеинов не выявлено. Протеин VP2 (IPNV) О-гликозилирован.

Организация генома и репликация. Организация сегмента А разных бирнавирусов сходна, хотя отмечается некоторое различие по размеру протеинов. сегмент А генома IPNV имеет 2 ORFs: ORF1 кодирует протеин с Mr 17х10³, а ORF2 с перекрывающейся рамкой считывания кодирует большой полипротеин с Mr 106х10³. У DXV ORF1 имеет сиквенс, кодирующий протеин с Mr 27х10³ (237 аминокислотных остатков), расположенный между участками, кодирующими VP4 и VP3. Сегмент В кодирует один крупный продукт (Mr 94х10³). Единичный цикл репродукции занимает 18-22 часа у IPNV и 6-8 часов у IBDV. Вируссвязывающие протеины (IBDV) обнаруживаются на поверхности разных типов клеток цыплят. После проникновения вируса в клетку активируется вирусная РНК-зависимая РНК полимераза, образующая 2 продукта, соответствующих длине генома, - (24S) мРНК, с каждой молекулы (14S) сегмента dsRNA. мРНК не кэпированы, а вновь образующиеся мРНК не содержат участков поли-А и связаны 5’-концом с VPg. Транскрипция вирусной РНК происходит по полуконсервативному механизму смещения цепи (strand displacement replication). Данных о синтезе минус-цепей РНК нет. Обе мРНК обнаруживаются в клетке через 3-4 часа после заражения и накапливаются в одинаковых пропорциях в течение всего репликативного цикла (молекул А примерно в 2 раза больше, чем молекул В). Вирусспецифические белки обнаруживаются в клетке через 4-5 часов после заражения, соотношение которых также сохраняется в течение всего репликативного цикла. Нет ранних или поздних протеинов. мРНК сегмента А транслируется в полипротеин (Mr 106х10³), содержащий (5’-3’) полипептиды VP2, NS и VP3. Считается, что NS котрансляционно разрезает полипротеин до образования трех полипептидов. Пре-VP2 процессируется разрезанием до образования VP2. Однако в зрелом вирионе обнаруживаются как VP2, так и пре-VP2. Продукт ORF c Mr 16,5-17 х 10³ обнаруживается в клетках, инфицированных как IBDV, так и IPNV. мРНК сегмента В транслируется в полипептид (Mr 94х10³), явялющийся вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (VP1). Этот продукт обнаруживается в вирионе как в “свободном” виде, так и в ассоциации с геномом.

Сборка и накопление вирусных частиц происходит в цитоплазме. Для IBDV характерно накопление VP4 в ядре и цитоплазме. Механизм высвобождения вируса не ясен. При культивировании в культуре клеток примерно половина популяции вируса остается клеточно-ассоциированной. In vitro (в зависимости от множественности заражения) образуются дефектные интерферирующие частицы.

Антигенные свойства. Мажерный капсидный протеин VP2 является типоспецифическим антигеном, содержащим вируснейтрализующие эпитопы. Анти-VP3 антитела не обладают нейтрализующей активностью. Между вирусами, относящимися к разным родам (вирусами рыб, птиц и насекомых), перекрестной серологической активности не наблюдается.

Биологические особенности. Естественными хозяевами IPNV являются лососевые, хотя вирус был выделен и от других пресноводных рыб, и от двустворчатых моллюсков. Распространение вируса может быть вертикальным и горизонтальным. Векторы (переносчики) не выявлены. Вирус распространен повсеместно и часто вызывает эпизоотии с высоким уровнем смертности мальков лососевых, содержащихся в искусственных условиях. Вирус вызывает некротические изменения поджелудочной железы, но обнаруживается и в других органах, таких как почки, гонады, кишечник, мозг и др. (без признаков их изменения). Взрослые инфицированные рыбы становятсся пожизненными носителями вируса без явных признаков проявления болезни.

Естественными хозяевами IBDV являются цыплята и индейки. В редких случаях вирус был выделен от уток и других видов домашней птицы. Распространение вируса происходит горизонтально, векторы не описаны. Вирус распространен повсеместно. Инфицирование цыплят раннего возраста сопровождается поражением фабрициевой сумки, приводящим к дефициту В-лимфоцитов. Смертность наблюдается у цыплят 3-6 месячного возраста и ассоциируется с воспалительными процессами фабрициевой сумки, образованием иммунных комплексов, истощением комплемента и нарушением тромбообразования.

Название вида вируса	Название на русском языке	№ генома	Аббр-ра
Infectious pancreatic necrosis virus Jasper SP serotype DRT N1	Вирус инфекционного некроза поджелудочной железы штамм Jasper серотип SP штамм DRT штамм N1	A:M18049,B:M58756 A:U56907, B:M58757 A:D26526, B:D26527 A:D00701	IPNV
Yellowtail ascites virus	Вирус асцита желтохвосток	A:AB006783	YTAV

Род: Avibirnavirus. Типовой вид: Infectious bursal disease virus (IBDV) (вирус инфекционной бурсальной болезни).

Биологические особенности. Инфицируют только птиц. Типовой вид (IBDV) вызывает болезнь у цыплят, характеризующуюся иммуносупрессией, обусловленной поражением лимфоидных клеток в фабрициевой сумке, в которой (как и в других лимфоидных органах) отмечается апоптоз клеток. Недавно было показано, что протеин VP2 индуцирует апоптоз трансфицированных клеток млекопитающих, что сходно с апоптозом В-лимфоцитов у инфицированных цыплят. Быстрое снижение количества В-клеток приводит к развитию иммуносупрессии и снижению резистентности к другим агентам. Вирус распространен повсеместно, характеризуется значительной контагиозностью и имеет большое экономическое значение в птицеводстве. В перекрестной нейтрализации идентифицировано 2 серотипа. Штаммы серотипа 1 патогенны для цыплят, тогда как штаммы серотипа 2 - не патогенны.

Название вида вируса	Название на русском	№ генома	Аббр -ра
Infectious bursal disease virus strain 002-73 strain STC strain UK661 strain KS strain OKYM attenuated strain OKYM strain QC-2 strain Farragher strain GPF-1E strain Cu-1 strain PBG-98 strain 52/70 strain Edgar strain OH strain Australian 002-73 strain P2 strain 23/82	Вирус инфекционной бурсальной болезни штамм 002-73 штамм STC штамм UK661 штамм KS штамм OKYM атте-ный шт OKYM штамм QC-2 штамм Farragher штамм GPF-1E штамм Cu-1 штамм PBG-98 штамм 52/70 штамм Edgar штамм OH шт Australian 002-73 штамм P2 штамм 23/82	A:M64738,B:M19336 A:D00499 A:X92762, X92760 A:L42284 A:D49707 A:D83985, D49706 B:U20950 A:A38328 A:EO5443 A:D00867, X16107 A:D00868 A:D00869 A:A33255 A:U30818, B:U30819 A:X03993, M24529, M27967, M64738 A:X84034,A:Z21971	IBDV

Сходство с другими таксонами. Бирнавирусы не имеют сходства по сиквенсам (нуклеотидным и аминокислотным, сегмент А) и антигенным свойствам с представителями других таксонов. РНК-зависимая РНК полимераза (RdRp), кодируемая сегментом В, имеет сходство с другими вирусными RdRp. Бирнавирусная RdRp имеет гидрофильный высокоосновный домен по карбоксильной части протеина. Внутри этого домена обнаружены консервативные аминокислоты, позиции которых совпадают с таковыми RdRp других вирусов, в особенности таких dsRNA-содержащих вирусов как реовирусов. Но, тем не менее, сиквенс не настолько консервативен, чтобы быть детектируемым по стандартным алгоритмам филогенетического родства.

Пикобирнавирус (Picobirnavirus) – предлагаемое название для нового рода вирусов, выделенных недавно от детей и некоторых видов животных, и отличающихся от существующих членов данного семейства. Эти вирусы икосаэдральной симметрии (Т=3), имеют диаметр 30-40 нм. Плавучая плотность в CsCl 1,4 г/см³. Их геном состоит из 2 или 3 сегментов dsRNA, имеющих длину 2,6 и 1,9 kbp – для двухсегментного генома и 2,9, 2,4 и 0,9 kbp – для трехсегментного генома. Вирусы обнаруживались в фекалиях животных с признаками диареи или без них.

Gumboro disease of poul try (IBR), Infections bursal disease (англ.); Cumboro- Krank heit, Ansteckende Bursa - Krankheit (нем.); Bursitis Infectiosa Calinae (лат.)

Инфекционный бурсит ИБ, болезнь Гамборо БГ; инфекционная бурсальная болезнь ИББ - остро протекающая, контагиозная болезнь, поражающая чаще всего цыплят 2-15-нед воз­раста. Проявляется диареей, апатией, отсутствием аппетита, иногда дрожью, вторичным нефрозом, поражением фабрициевой бурсы, внутримышечными геморрагиями. Впервые бо­лезнь зарегистрировали в 1957 г. в местечке Гамборо (США) на ряде птицеферм как конта­гиозную болезнь цыплят неизвестной этиологии с признаками поражения почек и фабри­циевой сумки. О специфическом возбудителе болезни впервые сообщил в 1962 г. Госгроу. Он назвал эту болезнь инфекционным нефрозом птиц из-за чрезвычайно сильного пораже­ния почек у экспериментально зараженных цыплят. Так как болезнь широко распространи­лась в окрестностях Гамборо, то название "болезнь Гамборо" стало ее синонимом. В даль­нейшем при попытке выделения этиологического агента произошла путаница в отношении этиологии синдрома нефроза птиц.

Поэтому в 1970 г. на 14-м Всемирном конгрессе по пти­цеводству в Испании предложено не пользоваться термином "болезнь Гамборо" в номенкла­туре заболеваний птиц, а принять название "инфекционый бурсит", подразумевая под ним поражение фабрициевой сумки, и как вторичный признак - нефроз. Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. Данные серологического исследования показывают, что зараженность стад колеблется от 2 до 100%. ИБ распространен преимуще­ственно в птицеводческих хозяйствах промышленного направления. Причиной этого счита­ют постоянный импорт птицы.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Вирус впервые описан в 1962 г. в районе Гамборо штате Делавер, США. Вначале забо­левание характеризовалось как птичий нефроз. Год спустя аналогичное заболевание было зарегистрировано в Австралии как "уремия". В 1962 г. вирус был выделен на КЭ, а за­болевание назвали "инфекционной бурсальной болезнью". Позднее заболевание с почечным синдромом было отнесено к инфекционному бронхиту, а заболевание с поражением бурсы Фабрициуса - к инфекционной бурсальной болезни.

Морфология и химический состав. Вирионы имеют форму 20-гранника, капсид со­стоит из 32 капсомеров, вирион безоболочечный, 55 нм в диаметре. У вируса установлена 2-спиральная РНК. Обнаружено 2 типа частиц вируса: большие - 55-60 нм и маленькие -18-22 нм при наличии одного поверхностного АГ. Вирус имеет 2 сегмента геномной РНК -А и В. Сегмент А кодирует полипротеин, который превращается в вирусные белки VP2, VP3, VP4 и VP5. РНК вируса в градиенте сахарозы седиментирует одним пиком с коэффициентом 14S, что соответствует мол.м. 2,2-10⁶ Д. Плавучая плотность ее в CsCl 1,62 г/см³, в градиенте сахарозы - 1,178 г/см³. Вирусная РНК на 95% устойчива к действию РНК-азы А. Белок VP3 обладает высокой иммуногенностью, он имеет эпитопы, индуцирующие син­тез ВНА. Из вируса выделен один из главных структурных белков VP2b и VP2a. Конформационный эпитоп белка VP 2а/2b - один из главных субъединиц вируса ИБ типа I, ответст­венных за иммуногенность. Результаты свидетельствуют о том, что выбор вакцинного штамма вируса ИБ должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма.

Устойчивость. Вирус резистентен к эфиру, хлороформу и изменению рН (2-11). Инактивируется при рН 12. Сохраняет активность при 56°С 5ч, при 60°С 30 мин, а при 30°С в сухом помещении 150-180 дн; в присутствии 0,5%-ного фенола или 0,125%-ного мертис-лята 1 ч.При воздействии 0,5%-ного формалина инактивируется за 6 ч, препаратами йода -за 2 мин при 23°С, 0,5%-ным хлорамином - за 10 мин. Устойчив к фотодинамии и УФ-облучению, чувствителен к актиномицину Д.

Антигенная структура, вариабельность и родство. В структуре вируса обнаружено 5 белков. В структуре вириона выявлены белки VP1, VP2b (происходящий из VP2), VP2a предшественник протеина VP2 и VP3. Протеин VP2 ответственен за индукцию ВНА и типоспецифичность, а группоспецифичность обеспечивается белком VP3. Серотип I, выде­ленный от цыплят и патогенный для них, насчитывает 6 подтипов. Серотип II, изолирован­ный от индеек, не патогенен для цыплят и индюшат, однако в отдельных случаях вызывает поражение респираторного тракта и суставов у индюшек до 16-нед возраста.

В 1986 г. идентифицировано уже 3 серотипа вируса. Вирус 1-го серотипа содержит белки VP1, VP2, VP3 и VP4, а также белок VPx, который является предшественником VP2. У вируса 2-го серотипа обнаружены белки, соответствующие VP1, VP2, VP3 и VP4. В Англии в подав­ляющем большинстве стад кур AT обнаружены одновременно к обоим серотипам. Между вирусами 2-х серотипов существует лишь небольшое АГ-родство.

У индеек установлено 2 серотипа вируса ИБ. Множество АГ вариантов вируса ИБ делится серологическими методами на несколько групп: гомология меньше 10% - различия в серотипе, гомология 10-32% - большой подтип, гомология 33-70% - малый подтип, гомология 71-100% - слабое различие или его отсутст­вие. Все штаммы данного вируса иммуносупрессивны. Смертность и иммуносупрессия свя­заны со стандартными и высоковирулентными штаммами 1-го серотипа. До 1980 г. преоб­ладала циркуляция стандартного вируса, позже - его варианты.

Вакцинация цыплят серотипом I не снимает возможную иммунодепрессию и экономические потери при инфицировании серологически отличными вариантами.

В России изучена АГ вариабельность 6 вакцинных штаммов вируса ИБ с целью их эффективного применени. Вакцин­ные штаммы подразделяются на 2 группы, которые существенно отличались друг от друга (8% аминокислотных замен). Выбор вакцинного штамма вируса ИБ должен проводиться с учетом АГ структуры эпизоотического штамма. Целесообразно использовать вакцинный штамм, обладающий наибольшей степенью гомо­логии в области АГ-детерминанты с эпизоотическим штаммом вируса ИБ. АГ вариа­бельность штаммов, изолированных в России, изучена методом прямого секвенирования.

Локализация вируса. На 3-й день после экспериментального заражения 4-4,5-нед цып­лят вирус в высоких концентрациях накапливается в фабрициевой сумке и селезенке, и в более низких концентрациях - в мозге и крови. Из бурсальной ткани его выделяли до 14-го дня после заражения, в ИФ - до 5-6-го, в ИД - до 3-4-го дня. У 1-дн цыплят через 3 дня по­сле введения вируса отмечена высокая концентрация его в фабрициевой сумке, печени и почках. Вирус хорошо реплицируется в макрофагах и несколько хуже - в ретикулярных клетках, гетерофилах, эпителиальных клетках. Недавно было показано, что вирус размно­жается в лимфоцитах. Лимфолитические явления наблюдались через 8 ч после заражения. При экспериментальном заражении вирус удавалось выделять в течение 10 дн, однако патологические изменения в фабрициевой сумке сохранялись до 10 нед после заражения. Это указывает на малую вероятность носительства вируса, кратковременность его нахо­ждения в крови и возможность длительного обнаружения поражений фабрициевой сумки

Антигенная активность. Через 3 нед после заражения 3-6-нед цыплят вирусом в сы­воротках крови обнаруживают ВНА (достигают титра 1:718) и ПА. К 14-му дню титр ПА достигал 1:128, и цыплята приобретали устойчивость к заражению патогенным вирусом. AT у кур-несушек передаются потомству трансовариально. ПА в сыворотке крови появляются у птиц на 7-й, в фабрициевой сумке - на 12-й, в селезенке - на 15-й день после заражения. ВНА в индюшиных хозяйствах Германии устанавливали сразу после вылупления птенцов. Количество положительных сывороток к серотипу I варьировало от 65 до 80%, в других же хозяйствах количество положительных сывороток к серотипу II достигало 75-100%.

Экспериментальная инфекция. Воспроизводится на 20-30-дн цыплятах при инокуля­ции им вируссодержащего материала на слизистую оболочку глаз, в фабрициеву сумку или per os. Первые признаки болезни проявляются тремором головы и тела, а через 48 ч - диа­реей. На 3-й день фекалии становятся беловатыми и содержат слизь, но к 7-му дню болезни приобретают нормальный вид. На 3-4-й день после заражения у цыплят отмечали увеличе­ние фабрициевой сумки в 1,5-2 раза и отек. Бурса мягкая, бугристая, содержала вязкий слизистый материал, внутренние складки воспалены и желтого цвета. На 22-23 сут после зара­жения фабрициева сумка обычно уменьшается, консистенция ее становится плотной и на разрезе гладкой, слизь отсутствует. В эпителиальных и ретикулярных клетках пораженных фолликулов обычно обнаруживались ацидофильные включения, окруженные светлым ареа­лом. Некротические участки фолликулов обильно заселены макрофагами. У части отмеча­ют псевдокисты. Через 3-5 да после заражения патологические изменения фабрициевой сумки были настолько выраженными, что болезнь диагностировалась без затруднения.

На ЗЗ, 51 и 71 дни после заражения можно наблюдать атрофию бурсы. У 1-3 сут белых мышей при интраперитонеальном и интрацеребральном их заражениях (шт. Becht) отмеча­ли зуд, атаксию, дрожь, кому и негнойные лимфоцитарные воспаления мозговой ткани, со­провождавшиеся некрозом, демиелинизацией и скоплением лейкоцитов вокруг кровенос­ных сосудов. Крысы и хомяки также оказались чувствительными к интрацеребральному за­ражению. Индейки клинически не реагировали, но образовывали ПА и ВНА. Голуби, утки, гуси и перепела к экспериментальному заражению оказались резистентны. После интрабурсального заражения здоровых цыплят вирусный АГ в тканях фабрициевой сумки по­являлся в 100% случаев через 12-14 ч и обнаруживался с помощью МФА и РДП. Утки чувствительны к вирусу ИБ серотипов I и II, но не проявляют клинических симптомов бо­лезни, между тем серотип II широко распространен в природе. Патогенность вируса для утят сравнительно низкая, и переболевание сопровождается анорексией с небольшим подъ­емом температуры в течение 4-5 дн после заражения.

Культивирование. Вирус можно культивировать в КЭ, свободных от материнских AT к ряду вирусных болезней, в том числе и к ИБ. Помимо эмбрионов вирус удается культиви­ровать и на SPF-цыплятах. У инфицированных эмбрионов вирус накапливается в желточ­ном мешке и в меньшей степени - в аллантоисной жидкости. Гибель КЭ наступает на 3-8-й день после заражения. У погибших отмечали отечность брюшной полости, кровоизлияния и некрозы на теле, некроз и кровоизлияния в печени, почках, гиперемию легких. На ХАО ви­димых поражений не развивается, лишь иногда обнаруживают небольшие кровоизлияния. Отмечены "бледное сердце", гиперемия и некроз почек, гиперемия легких. Японские штам­мы вируса размножаются в утиных эмбрионах (лучше при заражении на ХАО, чем в жел­точный мешок) и в культуре утиных фибробластов, но не в культуре клеток почки. Вирус хорошо репродуцируется в культуре почечных клеток КЭ, вызывая на 3-5-й день заражения ЦПД. Данная культура пригодна для титрования вируса, последовательные пассажи в ней не ведут к аттенуации вируса в отношении цыплят. В культуре фибробластов КЭ вирус об­разует бляшки. В-клетки высокочувствительны к вирусу, а Т-клетки - нечувствитель­ны.