Молекулярная медицина и фармация

Молекулярная медицина использует методы генетической инженерии. Секвенирование генома – определение последовательности нуклеотидов при расшифровке геномов. Вначале ДНК разрезают на фрагменты бактериальными рестриктазами, затем происходит гибридизация с помощью ДНК-микрочипов. ДНК-микрочипы это пластина, на которой помещены микроячейки. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированный олигонуклеотид, соответствующий фрагменту определенного гена. На поверхности ячеек происходит комплементарное взаимодействие матрицы и исследуемой пробы ДНК.

ПЦР (полимеразная цепная реакция ) используется в диагностике инфекционных и онкологических заболеваний. Метод позволяет в несколько раз сократить время постановки диагноза, идентифицировать вирусы, раковые клетки, обнаружить которые в обычной практике невозможно (диагностика по 1-2 клеткам, одному волосу, геномная дактилоскопия и т.д.). Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать invitro небольшие участки ДНК и за 3-4 часа получить миллионы копий. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды, лейкоциты, корни волос, соскоб ротовой слизистой, сперма.

Трансгеноз – перенос генов в другие клетки и организмы. Теоретически подходят многие клетки: фибробласты, лимфоциты, гепатоциты, эндотелиальные, мышечные, стволовые клетки костного мозга. Запрещены для “пересадки генов” половые клетки (семенники и яичники).

Для развития медицины важно установить патогенез наследственных и мультифакторных заболевани. «Нокаут генов» – направленное разрушение определенного участка с помощью вектора. Вектор – это ДНК, способная встраиваться в геном. Создано множество линий мышей с «нокаутированными» генами, которые используются в качестве моделей для изучения различных заболеваний. Например, на мышах создана модель болезни Альцхаймера и установлено, что в гене белка-предшественника амилоида существует мутация– аминокислота валин замещена на аминокислоту фенилаланин.

Генотерапия возможна путём invivo– это инъекция «терапевтического гена» непосредственно в ткани пациента с использованием вирусов, липосом, полимерных микросфер. Для генотерапии exvivoнеобходимо:

· получение клеток от больного,

· перенос нужного гена для исправления дефектного,

· отбор и наращивание клеток,

· инфузия или трансплантация клеток пациенту.

ДНК-вакцины –это не чужеродный белок, меньше нагрузка на иммунитет, меньше осложнений, меньше опасность стать носителем каких-либо вирусов. Такие вакцины легче готовить, хранить, транспортировать (ДНК стабильнее белка). Кроме того, возможна модификация уже готовых вакцин, можно получить одну вакцину от нескольких заболеваний.

Основной постулат молекулярной медицины: – “Для каждой болезни есть молекулярная мишень и её можно использовать для диагностики и/или лечения, т.е. для лекарственного воздействия”. В настоящее время главными лекарственными мишенями являются рецепторы (45%), затем идут ферменты (28%) и гормоны (11%).Традиционный способ получения лекарств – это скрининг биологической активности природных соединений, или химическая модификация уже известных. Новые методы разработки лекарств появились с возможностью манипулирования молекулами ДНК и с расшифровкой генома человека. Уже с начала 80-х годов получают рекомбинантные лекарственные препараты с помощью биотехнологических методов. Получены рекомбинантные соматотропин, инсулин, соматостатин, цитокины.Рекомбинантные ИФ-a и ИЛ-2 применяются при лечении рака почки и злокачественной меланомы, заболеваний, практически не поддающихся традиционной противоопухолевой терапии. Рекомбинантные гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин назначают после применения цитостатиков.

Для получения рекомбинантных лекарств используются некоторые микроорганизмы, например E. coli. Получение инсулина включает несколько этапов. Выделение гена (химико-ферментный синтез гена проинсулина + регуляторный участок), встраивание гена в плазмиду. Для этого из неё удаляют часть ДНК рестриктазами, смешивают ген и плазмиду и с помощью ДНК-лигаз создают рекомбинантную кольцевую плазмиду. Такая плазмида является вектором (проводником) гена в клетку, ею инфицируют E. coli. Трансформированная кишечная палочка имеет ген проинсулина человека. Создаются условия для экспрессии этого гена, выделяют, очищают и получают генноинженерный инсулин человека.

Более безопасным методом получения лекарств белково-пептидной природы является использование трансгенных животных в качестве биореакторов. Например, трансгенные козы используются для получения активатора плазминогена (лечение тромбоза), овцы – IX фактора системы свёртывания крови (гемофилия), кролики – интерлейкина-2 (иммуные и злокачественные болезни). Для получения белков медицинского назначения экономически выгодны трансгенные растения. Примеры: табак используют для получения эритропоэтина, эпидермального фактора роста, b-интерферонов.

Дальнейшее развитие медицины и фармации происходит в связи с её всё большей “генетизацией”. Новые возможности появились в связи с расшифровкой генома человека - “генетический паспорт”. В России (Санкт-Петербург) разработано генетическое тестирование для более 25 болезней: ИБС, СД, гипертония, рак молочной и предстательной желез, наркомании, бронхиальной астмы. Индивидуальное прогнозирование болезни позволит планировать индивидуальные мероприятия по их предупреждению. Это задачи превентивной (предупредительной) медицины.

Переход от диагностики заболевания к его прогнозированию путем тестирования генов предрасположенности позволит предупреждать такие заболевания как гипертония, сахарный диабет, ожирение, шизофрения, рак щитовидной железы, рак молочной железы и др. Гены предрасположенности – это мутантные гены (аллели), которые совместимы с рождением и жизнью, но при определённых неблагоприятных условиях могут способствовать заболеваниям. Люди с медленной эпоксидгидролазой (в России 6% – гомозиготы) чувствительны к табачному дыму (эмфизема, пневмония). Людям с мутацией ангиотензинпревращающего фермента (ИБС, инфаркт) не показана чрезмерная физическая нагрузка.Для предупреждения заболевания в некоторых случаях необходима хирургическая операция, в других – максимально эффективные дозы лекарства с учетом генов, ответственных за их биотрансформацию (бронхиальная астма), в третьих – диета с определёнными ограничениями (сахарный диабет, атеросклероз).

Одной из задач превентивной медицины является планирование методов молекулярного лекарственного воздействия. Показано, что 50% неблагоприятных реакций на лекарства связаны с генами. Индивидуальную максимально эффективную и максимально безопасную дозу лекарства обеспечит развитие фармакогенетики и фармакогеномики. Фармакогенетика изучает значение наследственности в реакции организма на лекарства. Реакции могут быть типичными или атипичными. Необходим анализ причин низкой или наоборот повышенной чувствительности к лекарствам.У разных людей одна и та же доза лекарства может вызывать:

· у одних необычно сильный эффект

· у других необычно слабый эффект

· у третьих парадоксальный эффект (например, наследственная акаталаземия была открыта случайно: при обработке слизистой носоглотки и ротовой полости перекисью водорода возникало не пенообразование, а коричневая окраска).

Генетические различия по отношению к лекарствам связаны с генетическим полиморфизмом в человеческих популяциях. Наследственные различия имеют место и в процессе всасывания, и в процессе распределения, и в процессе взаимодействия лекарства с рецептором или другой мишенью, а также и в процессе биотрансформации лекарства в организме. Известны мутации, которые вызывают патологическую реакцию на лекарства. Самый распространенный фармакогенетический дефект это недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (~у 200млн чел.). У этих людей наблюдается гемолиз эритроцитов при приёме примахина, многих сульфаниламидов и некоторых других лекарств. Гемолитическая желтуха сопровождается ознобом, гиподинамией, количество эритроцитов £2 млн., в тяжёлых случаях коллапс. У пациентов с недостаточностью метгемоглобинредуктазы после приёма фенацетина, примахина и некоторых других лекарств возникает цианоз. Патологическая реакция может проявляться в виде гипербилирубинемии, образовании билирубиновых камней в желчевыводящих путях, образовании камней в почках и т.д.

Патологическая реакция на лекарства может быть связана с задержкой выведения метаболитов. Впервые Харрис (1958 г.) и Эвандс (1960г.) показали, что скорость метаболизма противотуберкулёзного препарата изониазида (тубазида) распределяется бимодально (двухвершинно). У одних время полувыведения (Т_1/2 составляет 60 минут, у других 240 минут). Причина оказалась в различной активности N-ацетилтрансферазы. Впоследствии это же явление было доказано и для других лекарств: апрессина, новокаинамида, пенициллина, сульфаниламидов. Различная активность ацетилтрансферазы предопределена генетически. Интересно, что в разных этнических группах соотношение быстрых и медленных ацетиляторов различно. У европейцев и негроидов оно примерно равное (50% на 50%). Среди египтян преобладают медленные ацетиляторы (82%).

Явление полиморфизма показано также для окислительных ферментов (монооксигеназные системы микросом). Для этих ферментов доказана тримодальность в распределении активности:

· «медленные окислители» (гомозиготы по рецессивному гену)

· «быстрые окислители» (гомозиготы по доминантному гену)

· «средние окислители» (гетерозиготы).

При этом «медленные окислители» могут быть «быстрыми ацетиляторами» и наоборот. На больших популяциях показана компенсация недостаточности одних систем другими.

Переход на индивидуализацию эффективной и безопасной дозы препарата возможен. Это автоматический скрининг концентрации лекарства в крови и автоматическая коррекция. Она проводится в некоторых клиниках при лечениисердечно-сосудистых заболеваний, некоторых вирусных инфекций. В будущем на основе «генетического паспорта» станет возможной не только индивидуализация дозировки, но и индивидуализация возможных побочных эффектов, мутагенеза и канцерогенеза под действием лекарств. В практике используются микрочипы для тестирования лиц – «медленных метаболизаторов».

Фармакогеномика изучает структуру и функцию генов, которые экспрессируются под воздействием лекарства или изучаемого соединения – возможного лекарства. Такая информация даёт возможность целенаправленной регуляции этих генов – геномная лекарственная терапия. Основные задачи фармакогеномики:

· разработка основ индивидуальной терапии;

· создание новых лекарств направленных на гены, специфически влияющих на отдельные звенья патологического процесса.

Так как разнообразие ответов на один и тот же лекарственный препарат чаще всего связано с однонуклеотидным полиморфизмом генов, однонуклеотидные замены могут быть эффективными фармакогенетическими маркёрами. Например, существует полиморфизм рецепторов дофамина: наиболее высокий риск алкоголизма, наркомании и др. нарушений поведения связан с А₁-1D₂ -рецепторами. Это важно для оценки профессиональной пригодности обследуемых лиц, превентивных и лечебных мероприятий.

Одним из направлений фармакогеномики является массовый скрининг с помощью микрочипов вновь синтезированных соединений. Потенциальные лекарства можно отбирать, сопоставляя характер экспрессии генов с известным, сходным по механизму действия, эталонным лекарством. Например, так пытаются получать новые ГКС.