Работа №3. Электрофоретическое фракционирование белков сыворотки крови на мембране из ацетатцеллюлозы

Принцип метода Принцип фракционирования основан на том, что в электростатическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором ацетатцеллюлозной пленке со скоростью, зависящей в основном от величины электриче­ского заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыво­ротки крови разделяются обычно на 5 основных фракций: альбумин и альфа­1_, альфа-2-, бета-, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью денситометрии (сканирования).

Материал для исследования. Сыворотка крови человека.

Растворы. 1. Электродный буфер — веронал-мединаловый, рН 8,6. Состав буфера: 1) 5,5-диэтилбарбитуровая кислота — 1,84 г/л; 2) натриевая соль 5,5-диэтилбарбиту-ровой кислоты — 10,27 г/л. Реактивы растворяют в дис­тиллированной воде при постоянном перемешивании и нагревании приблизительно до температуры 50 ⁰ С, после остывания доводят в мерной колбе до 1 л. Стабилен до 2 мес при комнатной температуре и более при температу­ре 2—8 °С. Приготовленным раствором можно пользо­ваться до 6 мес.

2. Раствор красителя пунцового «С» готовят на 3 % рас­творах трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и сульфосалициловой кислоты, которые являются фиксирующими аген­тами. Концентрация красителя 3 г/л. Хранят в посуде из темного стекла, годен для многократного использования.

3. Отмывающий раствор: 5—7 % раствор уксусной ки­слоты.

Оборудование. Прибор для электрофореза; компьютер; сканер, принтер; апплика­тор; сосуд для сыворотки; ванночки для отмывания мем­бран из ацетатцеллюлозы; фильтровальная бумага.

Ход определения.

1. Наливаем буфер комнатной температуры в камеру деления и посуду.

2. Включаем источник питания.

3. Наливаем буфер, краску и уксус в емкости для реагентов.

4. Помещаем пленку в буфер на 10 мин.

5. Отжимаем пленку фильтровальной бумагой.

6. Определяем рабочую сторону пленки

7. Закрепляем пленку в мостике и маркируем нижний правый угол зубцами перфоратора, расположенного у цветной детали мостика.

8. Помещаем мостик с пленкой в камеру и нажимаем кнопку «ПУСК» два раза (процедура префореза).

9. Раскапываем образцы сыворотки в планшет - 40 мкл в лунку, следим, чтобы не было пузырьков.

10. Через 10 минут на источнике питания нажимаем кнопку СТОП, открываем крышку.

11. Устанавливаем аппликатор на планшет, нажимаем на клавишу аппликатора, после чего наносим пробу аппликатором сначала на специальный мостик для снятия излишек плазмы, а затем на пленку непосредственно в камере (не вынимая мостик из камеры).

12. Закрываем крышку и нажимаем кнопку «ПУСК» два раза.

13. Раскапывающую часть аппликатора и планшет дезинфицируем 3%-м раствором перекиси водорода и промываем водой.

Не допускается обработка аппликатора спиртом и гипохлоридом натрия!!!

14. По окончанию времени электрофореза вынимаем пленку из камеры, помещаем в краску на 5-10 минут, затем поочередно в отмывающий раствор «1» и «2» на 4-6 минут в каждую емкость.