Работа № 12 Определение билирубина

Принцип метода

Билирубин вступает в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием раствора азокрасителя, который фотометрируют. Определение общего (неконъюгированного и прямого) билирубина проводят в растворе акцелератора, определение прямого (конъюгированного) билирубина – без акцелератора.

Реактивы

1) Сульфаниловая кислота раствор 30 ммоль/л в растворе хлористоводородной кислоты 150 ммоль/л (60мл)

2) Буферный раствор натрий – калий виннокислый 0,93 моль/л в растворе натрия гидроокись 1,9 моль/л (120мл)

3) Акцелератор кофеин 0,26 моль/л, натрий бензойнокислый 0,52 моль/л (120мл)

4) Натрий азотистокислый раствор 0,025 моль/л (10мл)

5) Эталон билирубина для приготовления раствора а мкмоль/л (1 флакон)

6) Альбумин для приготовления раствора 20 г/л (1 флакон)

Состав реакционной смеси

1) Сульфаниловая кислота (2,50ммоль/л)

2) Хлористоводородная кислота (12,50ммоль/л)

3) Натрий бензойнокислый (0,22моль/л)

4) Натрий – калий виннокислый (0,39моль/л)

5) Кофеин (0,11моль/л)

6) Натрия гидроокись (0,16моль/л)

7) Соотношение сыворотка/реакционная смесь (1/12)

Определение общего билирубина.

Длина волны (580 – 620) нм, кювета 1 см, температура (с +15 до +25).

Отмерить (мл)	Контрольный раствор 1	Контрольный раствор 2	Проба
Реактив 1	0,2	0,2	0,2
Реактив 2	0,05	-	0,05
Реактив 3	1,00	1,00	1,00
Физ. раствор	0,2	0,05	-
Сыворотка крови	-	0,2	0,2
Перемешивают и в течение (10 – 50) мин добавляют
Реактив 2	1,00	1,00	1,00
Перемешивают и в течение 5-60 мин измеряют плотность пробы (А1) и контрольного раствора (А2) против контрольного раствора 1.

Определение прямого билирубина

Длина волны (510 – 550) нм, кювета 1 см, температура (с +15 до +25)

Отмерить (мл)	Контрольный раствор 1	Контрольный раствор 2	Проба
Реактив 1
Реактив 4
Физ. раствор
Сыворотка крови
Перемешивают и точно через 5 мин измеряют плотность пробы (А1) и контрольного раствора (А2) против контрольного раствора 1.

Калибровка

Приготовление рабочих растворов для калибровки.

Раствор билирубина

Во флакон с Реактивом 5 (билирубин) отмеривают точно 4 мл дистиллированной воды, флакон закрывают и его содержимое растворяют, осторожно перемешивая. Раствор содержит точно а мкмоль билирубина/л. При температуре (+2 - +8) р-р устойчив 3 дня

Раствор альбумина

Во флакон с Реактивом 6 (альбумин) отмеривают точно 8 мл дистиллированной воды и его содержимое растворяют, осторожно перемешивая. Раствор содержит около 20г альбумина/л. При температуре (+2 - +8) р-р устойчив минимально 1 неделю.