Работа №17 Определение уровня общих липидов в сыворотке крови по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом

Гравиметрические метод;

Окиелительные методы;

Методы, основанные на свойстве липидов сыворотки избирательно окрашиватьсясуданом черным (или другим растворителем, проявляющим «сродство» липидам). Эти способы просты в исполнении, но отличаются плохой вос­производимостью.

Турбидиметрические методы, базирующиеся на сравнении степени мутнос­ти стандартной и исследуемой проб.

Методы, основанные на цветной реакции (описанной в 1937 г. Чабролом и Чаронатом), развивающейся при взаимодействии продуктов распада ненасыщен­ных липидов с реактивом, включающим в себя ванилин, фосфорную и серную кислоты (сульфофосфованилиновый реактив).

Принцип метода. Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом (состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина) соеди­нение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию об­щих липидов в сыворотке крови.

Реактивы

1. Серная кислота, концентрированная, для пробы Саваля.

2. Ортофосфорная кислота, концентрированная.

3. 6 г/л водный раствор ванилина. 0,6 г ванилина растворяют в небольшом
количестве дистиллированной воды при нагревании смеси на водяной
бане; после охлаждения объем доводят водой до 100 мл. Раствор стабилен,
если хранить его при комнатной температуре.

4. Фосфорнованилиновая смесь. 4 объема концентрированной ортофо''
форной кислоты смешивают с одним объемом 6 г/л раствора ванилина
Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температура

5. Хлороформ, х.ч. или «для наркоза».

6.Основной (12,0 г/л) стандартный раствор триолеина. На весах взвешивают в бюксе 1200 мг триолеина, навеску переносят ную колбу на 100 мл и доводят объем хлороформом до метки. Раствор содержат в холодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.

Ход определения.

В три пробирки наливают по 2,5 мл конц. Н₂SO₄ добавляют в первую 0,05 мл исследуемой сыворотки крови /проба/, во вторую - 0,05 мл реактива I /стандарт/ и в третью - 0,05 мл диет. Н₂О /контроль/. Перемешивают и нагревают 15 мин. на кипящей водяной бане. После охлаждения под проточной водой отбирают из каждой пробирки по 0,2 мл смеси и переносят в другую пробирку, содержащую 3,0 мл реактива 2. Оставляют стоять 45 мин. при комнатной температуре в темноте. Затем фотометрируют опытную пробу /А₁/ и стандарт /А₂/ против контроля.

Длина волны 510-550 нм, кювета 0,5см.

Расчет производят по формуле

С_оп (г/л) = Ао_П: Act • С_ст,

где А - абсорбция опытных и стандартных проб, С_ст — концентрация ос­новного стандартного раствора (12,0 г/л).

Норма - 4,0-8,0 г/л.