Работа №19 Определение уровня общих фосфолипидов в сыворотке крови по содержанию липидного фосфора

Фосфолипиды (ФЛ) представляют собой группу липидов, содержащих помимо фосфорной кислоты (в качестве обязательного компонента) спирт (обычно глицерин), остатки жирных кислот и азотистые основания. В зависимости от природы спирта ФЛ подразделяют на фосфоглицериды, фосфосфингозины и фосфоинозитиды.

В то время, когда не было известно о существовании различных фракций обшие фосфолипиды плазмы ошибочно отождествляли с одним только лицитином. Сейчас доказано, что лецитин составляет 57—75% фосфолипидов, включающих в себя также сфингомиелины (17—24%), лизолецитины (2—16%) и кефалины (2—4%). Поэтому по уровню липидного фосфора плазмы (сыворотки) следует судить о содержании в ней общих ФЛ, но не лецитинов. На долю липидного фосфора приходится 4% от усредненной молекулярной массы ФЛ. Умножив найденный в результате исследования показатель массовой концентрации липидного фосфора на 25, определяют содержание общих ФЛ.

Принцип метода. Содержащие фосфолипиды липопротеины осаждают трихлоруксусной кислотой, проводят термический гидролиз и разрушение органических веществ белкового преципитата в присутствии хлорной кислоты, устанавливают содержание липидного фосфора и по его концентрации судят об уровне общих фосфолипидов.

1. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л.

2. Хлорная кислота, 80% р-р

3. Молибдат аммония, 4% р-р;

4. Основной раствор эйкогена /аминонафтолсульфоновой к-ты/: в 100 мл Н₂О растворяют 30 г NаНSО₄ и добавляют 0,5 г эйкогена; отдельно в 30-50 мл Н₂О растворяют 6 г NаSОз; оба раствора смешивают и доводят до 250 мл дист. водой;

5. Основной станд. раствор КН₂РО₄: 4,39 г КН₂РО₄ растворяют в мерной колбе на I л и добавляют 1 каплю хлороформа; 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора;

6. Рабочий стандартн. раствор КН₂РО₄ готовят разведением основного раствора в 100 раз; 1 мл его содержит 0,01 мг фосфора.

Ход определения:

Берут 0,2 мл сыворотки, добавляют 3 мл даст, воды и 3 мл ТХУ: первые 1,5 мл по каплям, остальное сразу. Через 2 мин. центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку прибавляют 1 мл хлорной кислоты и для равномерного кипения 1-2 стеклянные бусинки. Пробирку нагревают на песочной бане(/1-180°С) пока смесь не станет бесцветной, затем охлаждают и добавляют дист, воды до объема 7 мл.

Контрольная проба. 0,8 мл раствора хлорной кислоты доводят до объема 7 мл дист. Н₂О.

Стандартные пробы. Готовят три пробирки, в которые берут по 2 мл рабочего станд. раствора и по 0,8 мл раствора хлорной кислоты. Все пробы доводят до объема 7 мл даст, водой.

Для определения фосфора в штативе пробирки располагают в следующем порядке: контрольная, две стандартных, опытная, стандартная. В каждую прилипают по 1 мл р-ра молибдата аммония, перемешивают, затем прибавляют по I мл р-ра эйкогена, доводят объем до 10 мл водой, снова перемешивают. Через 20 мин. фотометрируют при 670 нм (красный светофильтр) в кювете 1 см пробу и стандарты против контроля.

Расчет уровня липидного фосфора производят по формуле:

Соп (ммоль/л) = Аоп: Аст • 100мг/л.

У здоровых взрослых людей концентрация липидного фосфора составляет от 1,97 до 4,68 ммоль/л, среднее значение - 2,97 ммоль/л; массовая концент­рация общих фосфолипидов — от 1,52 до 3,62 г/л.