Работа №20 Определение триацилглицеридов (ТАГ)

Принцип. Триглицериды экстрагируются смесью гептана и изопропилового спирта, в которую переходят только неполярные липиды, а более полярные фосфолипиды остаются в водной фазе. Триглицериды гидролизуются щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетилацетоном фотометрически.

Оборудование: КФК-3, водяная баня, посуда, реактивы.

Реактивы:

1) Гептан;

2) Изопропиловый спирт;

3) Серная кислота, 0,08 н раствор;

4) Калия гидроокись, 6,25 н раствор;

5) Уксусная кислота, 50 г/л;

6) Йодная кислота: растворяют 0,6 г HJO₃ х 2 Н₂О /перйодная к-та/ в 100 мл 5% уксусной к-ты;

7) Аммония ацетат, 2 моль/л;

8) Ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона (СНзСОСH₂СОСНз) разводят раствором ацетата аммония до 200 мл;

9) Калибровочный исходный раствор триолеина, 2 ммоль/л: 510 мг триолеина растворяют в 100 мл изопропилового спирта. Его разводят водой 1:4 – это рабочий калибровочный раствор.

Ход определения:

К 0,5 мл сыворотки добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08н серной кислоты, перемешивают и через 5 минут центрифугируют при 3000 об/мин. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н КОН. Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане 10 мин. при 70°С. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, снова закрывают пробкой и еще нагревают 10 мин. при 70° С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют на ФЭКе (А₁) при длине волны 425 нм в кюветах 0,5 см против контрольной пробы, которую ставят так же как опытную, но вместе сыворотки берут 0,5 мл дистил. воды.

Калибровочную пробу (стандарт) тоже обрабатывают как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора. Фотометрируют против контрольной пробы (А₂). Развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л. Расчет проводят по формуле или калибровочному графику.

Расчет:

А₁

ТАГ (ммоль/л) = 2 ———

А₂

Примечание: При отсутствии триолеина для калибровки можно использовать растительное масло, принимая, что образующие его триглицериды имеют ту же молекулярную массу, что и триолеин. Можно использовать также раствор глицерина в этаноле, в этом случае его непосредственно добавляют к раствору КОН.