Особенности иммунного статуса у больных калицивирусной инфекцией

Многочисленными исследованиями установлено, что у детей при кишечных инфекциях могут иметь место нарушения как в системе специфической, так и в системе неспецифической резистентности, что объясняется как первичным (преморбидным), так и вторичным, (возникающим входе инфекционногопроцесса) иммунодефицитным состоянием. В большинстве случаев как при вирусных, так и бакте­риальных инфекциях уже в начальном периоде кишечных инфекций у детей имеют место угнетение клеточного (Т-хелперного) звена иммунитета, уменьшение IgA, снижение активности фагоцитоза и резервных возможностей фагоцитарно-метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов. Иммунный и цитокиновый статус детей, больных калицивирусной инфекцией, до настоящего времени прак­тически не изучался.

Нами проведено клинико-иммунологическое обследование 120 боль­ных калицивирусной инфекцией детей в динамике заболевания. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили с помощью панели моноклональных антител серии ИКО анти-СШ, анти-СЭ4, анти-CDS, анти-С016, анти-СЭ20, анти-С025, an™-CD95, производства НПЦ «Мсдбиоспектр» (Москва) в лимфоцитотоксическом тесте.

Определение уровня цитокинов в сыворотке крови (TNF-a, IFN-a, IFN-y, IL-1, IL-4, IL-6, IL-10) проводили методом твердофаз­ного иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструк­циями, прилагаемыми к наборам, производства ТОО «Протеиновый контур» (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург).

Пролиферативную активность Т-лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) на фитогемагглютинин (ФГА) фирмы «Difco» (США) в конечной концентрации 10 мкг/мл в культурах цельной крови с морфологическим учетом результатов. Супрессию про-лиферативного ответа устанавливали по числу бластных форм менее 65% - наименьшее значение показателя у здоровых детей.

Концентрацию иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии Manchini (1965) с использованием моноспеци­фических антисывороток предприятия по производству бактерийных препаратов Нижегородского НИИЭМ.

Определение общего пула ЦИК проводили методом преципита­ции полиэтиленгликолем (ПЭГ) по Digeon (1977), с использовани­ем 3,5% раствора ПЭГ 6000 («Serva», США), приготовленного на боратном буфере (рН = 8,5-8,7). Измерение оптической плотности проводили при длине волны >.=450 нм на фотометре планшетного типа АИФ-Ц-01С (Санкт-Петербург).

Нами показано, что острый период (2,7±0,09 день) калицивирусной инфекции у детей характеризовался значительными изме­нениями в иммунном статусе по сравнению со здоровыми детьми. Ответ иммунной системы на инфекцию в целом характеризовался снижением в циркуляции общего числа Т-лимфоцитов и особенно CD4+ Т-клеток, обладающих хелперными функциями (26,71 ±1,12% против 45,5±1,9%, р<0,001). Выявлена супрессия гуморального звена иммунного ответа: отмечена тенденция к снижению CD20+ (19,72±1,06% против 23,3±2,5%, р>0,05). Значительно снижены были показатели продукции иммуноглобулинов классов А по сравне­нию со здоровыми детьми (0,48±0.04 г/л против 1,0±0,09 г/л, р<0,01), М (0,7±0,04 г/л против 1,21 ±0,05 г/л, р<0,05), G (6,26±0,3 г/л про­тив 8,9±0,3 г/л, р<0,05), низком уровне ЦИК (0,061 ±0,001 против 0,111 ±0,01, р<0,001) что, вероятно, свидетельствует о переключе­нии на клеточную форму иммунной защиты. Кроме этого имелась тенденция к повышению числа CD16+ (натуральных киллеров) (18,5±0,96% против 15,5±1,8%, р>0,05) в сочетании с высоким синтезом TNF-a (152,59±42,83 против 19±4 пг/мл, р<0,01). Количе ство CD25+ и CD95 + активированных лимфоцитов укладывалось в «нормальные» колебания, но их соотношение свидетельствовало о преобладании лимфоцитов с маркером апоптоза (табл. 3).

Таблица 3

Иммунный статус детей с калицивирусной инфекцией в острую фазу болезни

Иммунологические показатели	Дети, больные калицивирусной инфекцией (п = 120) 120)	Здоровые дети (п = 10)	Р
CD3+ (%)	48,23 ±1,54	57,3 ±3,0	р<0,01
CD4+(%)	26,72*1,17	45,5 ±1,9	р<0,001
CD8+ (%)	20,52 ±1,058	21,2±1,8	-
CD 16+ (%)	18,5 ±0,97	15,5 ±1,8	-
CD20+ (%)	19,72±1,06	23,3 ±2,5	-
CD25+ (%)	18,3 ±0,95	18,8±1,8	—
CD95 + (%)	23,52 ±1,25	22,2 ±1,6	-
ЦИК (ед. опт. пл.)	0,06 ±0,001	0,111 ±0,01	р<0,001
спонт. РБТЛ (%)	3,29±0,18	0,6+0,1	p<0,0Ql
ФГА-РБТЛ (%)	65,75 ±1,77	75,0±1,5	р< 0,001
IgA(rto)	0,49 ±0,04	1,00±0,09	р<0,001
IgG(r/n)	6,26 ±0,30	8,9 ±0,30	р< 0,001
Ig M (г/л)	0,71 ±0,04	1,21 ±0,05	р< 0,001
IFN-a (пг/мл)	10,15±0,78	0,9±0,2	р< 0,001
IFN-y (пг/мл)	74.9 ±8.01	26±8	р< 0,001
IL-1 (пг/мл)	217,88 ±59,64	111 ±45	р<0,01
IL-4 (пг/мл)	32,11 ±13,98	51 ±7	р<0,001
IL-6 (пг/мл)	24,5 ±1,73	21,9±9,7	-
1L-10(пг/мл)	269,17±135,29	4,8 ±2,8	р< 0,001
TNF-a (пг/мл)	152,59 ±22,83	69,8 ±23,3	р<0,01

Согласно нашим данным, продукция цитокинов отражала особен­ности ответа иммунной системы на калицивирусы и тяжесть инфекции. Цитокиновый ответ в острую фазу заболевания характеризовался выраженной активацией синтеза провоспалительных цитокинов TNF-a (152,59±22,83 пг/мл против 69,8 ±23,3 пг/мл, р<0,01), IL-1 (217,88±59,64 против 111 ±45 пг/мл, р<0,01) при сниженной секреции противовоспалительного цитокина Th2-тина 1L-4 (32,11 ±13,98 пг/мл против 51 ±7 пг/мл, р>0,05) (табл. 3).

Ведущая роль в противовирусной защите принадлежит системе интерферонов (IFN) - цитокинов, обладающих уникальными антиви­русными свойствами. Известно, что IFN-a, продуцируемый макрофа­гами, обладает более сильной противовирусной активностью, а IFN-y, продуцируемый естественными киллерами, CD4+ и CD8+, является мощным индуктором неспецифической защиты и иммунорегуляторным цитокином. IFN-y-важнейший медиатор клеточного иммунного ответа Thl-типа, активирующий макрофаги, стимулирующий фагоци­тоз, а также киллинг возбудителя естественными киллерами.

В острый период заболевания нами выявлено достоверное повышение уровня IFN-a у всех больных калицивирусной инфекцией (10,15±0,78 пг/мл против 0,9±0,2 пг/мл у здоровых детей). Продукция IFN-y также повы­шалась (74,9±8,0 пг/мл против 26±8 пг/мл). При данной инфекции наи­более значительной была активация синтеза in vivo антивоспалительного цитокина IL-10 (269,17± 135,29 пг/мл против 4,8±2,8 пг/мл).

Нами проведено сравнение данных иммунного статуса в острой фазе калицивирусной инфекции у детей с легким, среднетяжелым и тяжелым течением заболевания. По мере утяжеления инфекции у больных нарастала лимфопения, уменьшалось число CD3+ и CD4+ Т-лимфоцитов в относительном и абсолютном выражении. По-видимому, это связано с накоплением Т-лимфоцитов в мукозальной иммунной системе кишечного тракта, степень которого зависит от величины вирусной нагрузки.

Уровень интерферонов обоих типов в циркуляции несколько снижался с нарастанием тяжести болезни, также как и содержание TL-1. По сравнению с легким течением заболевания больные с тяжелым течением отличались значительно более низкой продукцией IL-6, IL-10 и TNF-a (табл. 4).

Продукция цитокина Th2 IL-4 у детей с тяжелым течением за­болевания была достоверно ниже по сравнению с показателями у здоровых детей, подтверждая тем самым преимущественно клеточ­ный, Thl -зависимый, профиль иммунной защиты. По сравнению с

легким течением КВИ, больные среднетяжелой формой заболевания отличались сниженной продукцией IL-6 и IL-4, а также более высоким коэффициентом IFN-y/IL-4 (табл. 4). По-видимому, среднетяжелое течение ассоциировано с наиболее выраженным смещением баланса Thl/Th2 в сторону ТЫ.

При среднетяжелом течении КВИ у 10% детей вирус выделялся более 10-14 суток от начала болезни (против 5-6 суток в основной группе больных). Представляло интерес выяснить, с какими особен­ностями реакций иммунной защиты связана замедленная элиминация вируса из организма. С этой целью мы сравнили данные иммунного статуса в первые дни болезни у больных основной группы и у детей с длительным вирусовыделением.

В группе больных длительно выделявших калицивирусы значитель­ное количество иммунокомпетентных клеток оставалось в циркуляции, вероятно, из-за нарушения их рекрутирования в слизистые кишечного тракта. Это касается CD4+ (30,25 ±2,81% против 25,28±2,12%) и CD8+ (27,25 ±3.24% против 19,63±1,53%) Т-клеток, естественных килле­ров (21,75±1,49% против 18,52±0,92%) и активированных CD95 + (28,75 ±1,21% против 24,04± 1,08%) лимфоцитов. Наиболее значимой была разница между группами по содержанию в крови цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, при многих инфекциях составляющих главное звено в процессе уничтожения инфицированных клеток.

Сравнение функциональных показателей иммунного статуса выяв1$ло у больных с длительным сохранением вируса дефект в гуморальном звене иммунитета, а именно значительно сниженные относительно «нормы» концентрации в крови IgA и IgM (рис. 3). Уровень IgG был близок к нижним границам «нормы». Исходный дефицит IgA, основ­ного гуморального фактора зашиты слизистых оболочек ЖКТ, мог способствовать проникновению вируса в клетки и его сохранению на фоне недостатка продукции антител.

Реакция со стороны системы цитокинов у пациентов с длительным сохранением вируса в организме имела характерные отличия (Табл.5). Главным из них был дефицит продукции IFN-a, уровень которого не выходил за пределы физиологической «нормы». Недостаток IFN-a, ве­роятно, в ранние сроки приводил к быстрому распространению вируса и более длительному его сохранению в организме. Кроме того, у детей с длительным выделением вируса соотношение цитокинов Thl/Th2 было значительно ниже, чем в основной группе больных, что говорит об относительно слабом адаптивном ответе Тh1-типа.

Таблица 4

Показатели цитокинового статуса у больных КВИ в зависимости от тяжести заболевания

Иммунологические	Легкое течение	Среднетяжелое	Тяжелое
показатели	п=30	течение п=50	течение п=22	Р
IFN-ct (пг/мл)	10,0 ±4,23*	9,42 ±1,44*	8,49±4,3
IFN-y (пг/мл)	105 ±33,82*	63,1 ±8,93*	52,86± 17,57
IL-1 (пг/мл)	1100,17+367,64*	293,3±81,12	408,13±249,46
IL-4 (пг/мл)	61 ±39,62	45,68±20,44	8,93 ±3,03*
IFN-y/IL-4	2,85±1,16	7,26±1,49*	23,38 ±18,17*	Р2-3<0,01
IL-6 (пг/мл)	28±3	20,88 ±1,9	18,67±4,33
IL-8 (пг/мл)	123,6 ±38,62	142,95 ±35,39*	73,25 ±36,86	Р1-2<0.05,
IL-10 (пг/мл)	50 ±26,45	367,72 ±150,66*	10,43 ±3,34	Р2-3<0,01
TNF-a (пг/мл)	57,2±50,82	146,67±59,77	0,26 ±0,23*	Р2-3<0,05

· - показатели, достоверно отличающиеся от показателей здоровых детей (при р, по крайней мере <0,05).

Таблица 5.

Показатели интерферонового статуса и уровень IL-4 у детей с различными

сроками санации от калицивируса

Иммунологические показатели	Дети со среднетяжелым течением инфекции. санирующиеся на 1 неделе заболевания (п=25)	Дети со среднетяжелым течением инфекции и длительным вирусовыделением (п=11)	Здоровые дети (n = 10)
IFN-a (пг/мл) IFN-y (пг/мл) IL-4 (пг/мл) lFN-y/IL-4	7,86 ± 1,73:|: 65,75 ±11,83* 47,33 ±17,27 5,71 ±1,45*	4,66+2,1 61,1±16,13 13,78±4,13* 6,71 ±2,07*	0,9±0,2 26±8 51±7 1,8±0,2

* - показатели, достоверно отличающиеся от показателей здоровых детей (при р по крайней мере <0,05).

Дети с длительным выделением вируса имели относительно высокое содержание в крови CD8+ Т-лимфоцитов, дефицит IgA, IgM, IgG и IFN-a, недостаточно выраженный адаптивный ответ Тh1-типа.

Такие выраженные изменения в иммунном ответе свидетельству­ет о необходимости разработки дифференцированных подходов к иммуноорентированной терапии при калицивируснои инфекции у детей.