Регуляция экспрессии и модуляция активности метилтрансфераз

В связи с участием метилирования ДНК в переключении различных генетических программ клетки, должны существовать и механизмы регуляции экспрессии и модуляции активности самих ДНК-метилаз. Исследование этих механизмов находится пока на начальной стадии, причем в большей степени изучена регуляция экспрессии соответствующих генов. Отмечена скоординированная транскрипция генов ДНК-метилаз Dnmt1, DnmtЗа и Dnmt3b в нормальных тканях человека, однако она нарушена в опухолях. При этом на фоне умеренного повышения экспрессии генов Dnmt1и Dnmt ЗА наблюдается значительное повышение экспрессии гена Dnmt ЗВ. Сложная структура эукариотических генов ДНК-метилаз и кодируемых ими белков предполагает наличие у них разнообразных регуляторных элементов. На генном уровне одним из способов регуляции экспрессии ДНК-метилазных генов является альтернативный сплайсинг и транскрипция с разных промоторов. Так, ген Dnmt1 мыши (>56 т.п.н.) состоит из 39 экзонов размером от 32 до 352 п.н. Большая изоформа ДНК-метилазы Dnmt1транслируется с третьего АТG-кодона первого экзона и присутствует в эмбриональных стволовых клетках и соматических тканях, в то время как короткая изоформа транслируется с четвертого АТG-кодона четвертого экзона и обнаружена в ооцитах и преимплантированных эмбрионах.

Обнаружена тканеспецифичность различных изоформ ДНК-метилазы DnmtЗb человека. Два секс-специфических экзона гена Dnmt1контролируют его экспрессию в ооцитах млекопитающих. Не исключено, что различные изоформы ДНК-метилаз могут обладать различной субстратной специфичностью. Транскрипция человеческого гена Dnmt1может происходить с одного главного и трех минорных участков инициации и регулироваться независимыми промоторами и энхансерами, что соответствует существованию различных изоформ этого фермента в зародышевых и соматических клетках. Область главного промотора гена Dnmt1Р1 отличается высоким содержанием последовательностей СG, характерным для «хаус-киппинг» генов, а область минорных промоторов Р2—Р4 - дефицитом этих последовательностей.

Таким образом, метилирование самого ДНК-метилазного гена может регулировать его экспрессию. Действительно, в эмбриональных стволовых клетках мышей с высокой экспрессией гена Dnmt1, все динуклеотиды СрG в его промоторной области не метилированы, в то время как они метилированы в дифференцированных клетках и тканях. Между промоторами Р1 и Р2—Р4 расположены три энхансера, активируемых протоонкогенным сигналом Ras-с-jun и репрессируемые Rb-супрессором опухолей. Таким образом, регуляция транскрипции гена Dnmt1играет существенную роль в реализации нормальных и онкогенных программ клетки. В структуре гена Dnmt1мыши содержится регуляторный элемент АР-1, активируемый Ras-jun-протоонкогенным сигнальным путем. В АР-1-регуляторной области расположены 29 динуклеотидов СрG, выполняющих функцию сенсора состояния метилирования генома. Выдвинута гипотеза о регуляции экспрессии гена Dnmt1по принципу обратной связи. Согласно этой гипотезе конечный продукт реакции метилирования, т.е. метилированная ДНК, регулирует экспрессию гена Dnmt1 в цис- положении. Эта гипотеза объясняет парадоксальное явление сосуществования в раковых клетках общего недометилирования ДНК и высокого уровня ДНК-метилазной активности.

В ядре растительной клетки существует система контроля метилирования ДНК фитогормонами. Добавление к ядерным экстрактам проростков пшеницы гиббереллина, 6-бензиламино-пурина и фузикокцина повышает на 30-65% уровень метилирования ДНК пшеницы. В то же время эти фитогормоны не оказывают стимулирующего воздействия на активность частично очищенных ДНК-метилазных препаратов, что указывает на их опосредованное действие через ядерные белки. Как отмечено выше, в N-концевом домене большинства эукариотических ДНК-метилаз присутствуют разнообразные функционально значимые последовательности, определяющие их ассоциацию с ядерными белками (таблица). Это позволяет предположить, что происходит регуляция активности ДНК-метилаз на уровне белок-белковых взаимодействий. Так, Rb-супрессор опухолей способен модулировать активность метилазы Dnmt1человека. Протеолитический процессинг и энзиматические ковалентные модификации могут также модулировать активность ДНК-метилаз. В частности, модификация метилазы Dnmt3a убиквитиноподобным пептидом SUМО-1 модулирует ее взаимодействие с деацетилазами гистонов и функцию транскрипционного репрессора. Метилаза DnmtЗb также модифицируется пептидом SUМО-1. В настоящее время исследуется место метилирования ДНК в иерархии процессов установки эпигенетического статуса хроматина. Так, метилирование ДНК растений арабидопсиса в последовательностях СрNрG контролируется первичным метилированием гистона НЗ. Этот процесс осуществляется через взаимодействие хромометилазы СМТЗ с гомологом гетерохроматинового белка НР1, который, в свою очередь, взаимодействует с метилированным лизином 9 гистона НЗ (НЗlys9), модифицированным специфической лизиновой гистон-НЗ-метилтрансферазой. У N. сrassа экспрессия активности ДНК-метилазы dim-2 контролируется также гистоновой Н3lys9-метил-трансферазой. В свою очередь, метилирование Lys9 в гистоне НЗ может зависеть от первичного метилирования в ДНК последовательностей СрG. В последнее время установлено, что у большинства эукариотических организмов геномное метилирование осуществляют множественные ДНК-метилазы, специфически участвующие в различных генетических процессах, причем иногда без проявления своей каталитической метилтрансферазной функции. Даже в клетках низших эукариот с одной ДНК-метилазой этот фермент способен выполнять множественные функции и модифицировать иитознн в различных специфических последовательностях ДНК за счет еще недостаточно изученных модулирующих факторов.

Особый тип контролирования картины метилирования ДНК может осуществляться на уровне ДНК-белковых взаимодействий. Так, фактор транскрипции Sр1 часто ассоциируется с неметилированными СрG-островками в промоторах хаус-киппинг-генов, запрещая de novo метилирование СрG-островков и поддерживая конститутивную экспрессию этих генов. Делеция промоторной области гена АРRТ с GС-боксами или мутагенез в них Sр1-узнаваемых последовательностей с СрG-сайтами приводили к метилированию de novo СрG-островка этого гена.

Белки, так или иначе связанные с функционирование ДНК-метилаз приведены в таблице…..

В то же время белки, связывающиеся с метилированной ДНК, могут сохранять ее метилированное состояние. Поэтому следует отметить существование особого класса ДНК(m⁵СрG)-связывающихся белков. Не исключено, что такими белками может определяться существование жесткой обратной связи между СрG- и СрNрG-типами метилирования специфических генетических областей, а также существование безальтернативного СрG-типа их гиперметилирования при некоторых формах рака Возможно, экранирование одной из цепей ДНК специфическими белками вместе с модуляцией активности ДНК-метилаз приводит к дифференциальному массивному метилированию цитозина в одной из цепей ДНК центромерных областей хромосом проростков растений.

Надо отметить, что в клетке ДНК-метилазы действуют не на уровне простыхДНК-белковых комплексов, а на уровне ДНК в структуре сложно устроенного хроматина. На уровне хроматина окончательно реализуются взаимосвязи между модификацией генома и многочисленными эпигенетическими модификациями белков хроматина. В настоящее время актуально выяснение причинно-следственной последовательности процессов метилирования ДНК и энзиматических модификаций ядерных белков в установлении специфических структур хроматина.

Существен и вопрос о статусе различных сайт-специфических типов метилирования в картине метилирования генома в норме и патологии. Получение этой информации важно как для диагностики и прогнозирования заболеваний, связанных с аномальным метилированием ДНК, так и для их терапии. Поэтому необходимо разработать методы мониторинга отдельных структурно-функциональных типов метилирования тотального генома и субгеномньгх фракций, а также поиска маркерных аномально метилируемых последовательностей ДНК. Уже| сейчас достигнуты значительные успехи в получении геномной картины аномального метилирования СрG-островков, намечены некоторые подходы к анализу метилирования СрG-последовательностей в тотальном геноме и субгеномных фракциях, а также найдены маркеры аномального метилирования ДНК для некоторых форм канцерогенеза. Дальнейшие исследования структурно-функциональной картины метилирования эукариотического генома и путей его регуляции имеют большое значение для понимания молекулярных основ эпигенетических процессов.

Таблица….Белки, ассоциированные с метилтрансферазами