Вопросы. 1. Для каких целей используют питательные среды?

1. Для каких целей используют питательные среды?

2. На какие две группы делятся питательные среды?

3. Использование элективных и дифференциально-диагностических сред?

4.Что такое агар и желатин?

5. Что такое посев и пересев в микробиологии?

6. Что такое накопительная культура?

7. Что такое чистая культура?

8. Методики выделения чистых культур?

Приготовление препаратов живых клеток, фиксированных и окрашенных клеток.

Изучение морфологии микроорганизмов

(бактерии, плесневые грибы, дрожжи)

Лабораторная работа № 3, 4

Препараты микроорганизмов готовят на предметных стёклах и накрывают сверху покровными стёклами. Предметные стёкла – это пластинки (76 х 26 мм) из тонкого стекла с хорошо отшлифованными краями и толщиной, не превышающей 1,2-1,4 мм. Более толстые стёкла нарушают фокусировку конденсора и снижают чёткость изображения, что затрудняет работу с иммерсионным объективом. Покровные стёкла имеют следующие размеры: 18 х 18, 20 х 20, 18 х 24 мм и др. при толщине 0,15 – 0,17 мм. Покровные стёкла большей толщины ухудшают качество изображения. Предметные и покровные стёкла должны быть чистыми и тщательно обезжиренными, что особенно важно при приготовлении фиксированных препаратов. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки.

Микроорганизмы в живом состоянии рассматривают в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля», применяя сухие системы объективов.

Препарат «раздавленная капля». На середину предметного стекла наносят небольшую каплю воды, бульона или физиологического раствора (0,5%-ный раствор NaCl). В неё петлёй или иглой вносят культуру, отобранную с плотной среды, или другой исследуемый материал (дрожжи, тесто и др.) и хорошо размешивают до получения слабомутной суспензии. При рассмотрении микроорганизмов, выросших в жидких средах, каплю воды можно не наносить. Покровное стекло ставят на ребро у края капли с микроорганизмами и постепенно опускают, стараясь, чтобы между стёклами не образовались пузырьки воздуха, мешающие микроскопированию. Обратным концом петли или иглы прижимают покровное стекло к предметному. Излишек жидкости, выступающий за края покровного стекла, удаляют полоской фильтровальной бумаги. Приготовленный препарат исследуют сразу, так как жидкость высыхает и микроскопирование затрудняется. В препарате «раздавленная капля» в светлом и тёмном поле можно установить форму и размеры клеток, их физиологическое состояние, характер размножения, расположения спор, наличие запасных питательных веществ в клетке.

Препарат «висячая капля». Для приготовления препарата используют предметные стёкла с круглым отшлифованным углублением – лункой. Края лунки смазывают вазелином. На середину обезжиренного покровного стекла наносят маленькую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и осторожно прижимают к вазелиновому кольцу. Капля должна располагаться в центре лунки, не касаясь её краёв и дна. В таком препарате капля подвешена к внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой камере. Это позволяет её изучать в течение нескольких дней, наблюдая за ростом и размножением микроорганизмов, образованием и прорастанием спор, подвижностью клеток.

Фиксированными считают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура. Окрашенные фиксированные клетки и детали их строения резче выделяются на фоне препарата. Это облегчает изучение формы, размеров, внутренних элементов (ядра, оболочки, спор, включений), упрощает подсчет количества клеток. Фиксированные препараты обычно рассматривают с иммерсией. Приготовление окрашенных фиксированных препаратов по этапам: приготовление мазка, высушивание, фиксация и окраска мазка.

Приготовление мазка. Мазки готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах. Предметные стекла берут пинцетом или пальцами за ребра и проносят через пламя горелки, слегка обжигая, затем кладут обожженной поверхностью кверху на мостик (две параллельные стеклянные палочки, соединенные кусочками резинового шланга) над ванночкой. Готовят препарат «раздавленная капля» тщательно размешивают и краем покровного стекла или петлей распределяют на площади 1-2 см² тонким ровным слоем.

Высушивание мазка. Мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе. Правильно приготовленный мазок высыхает сразу после нанесения. Если высыхание протекает медленно, препарат мазком вверх поднимают высоко над пламенем горелки и осторожно сушат в теплом воздухе без подогрева стекла, иначе клетки деформируются.

Фиксация. Цель фиксации - умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными, что особенно важно при работе с патогенными культурами; плотно прикрепить клетки к стеклу, в результате чего они не смываются при последующих операциях; улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей.

Простым и распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого предметное стекло мазком вверх 3-5 раз проносят через наиболее горячую часть пламени горелки. Предметное стекло нагревают 2-3 с, пока не возникнет ощущение легкого жжения, если приложить его к кисти руки. Более длительная термическая фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму. Недостаточно хорошо зафиксированный мазок смывается со стекла при последующей обработке.

Окрашивание. Различают простые, сложные и дифференциальные способы окраски микроорганизмов. При простой окраске чаще используют один краситель и прокрашивают всю клетку. Это дает возможность четко определить формы и размеры клеток. Сложное окрашивание предусматривает применение двух или нескольких красителей, например, диагностическое определение отношения бактерий к окраске по Граму. Дифференциальное окрашивание основано на индивидуальном отношении биологических структур клетки к различным красителям (окраска спор, оболочки, ядра капсул, метахроматина и др.).

Отмытый от фиксатора мазок помещают на мостик, установленный над ванночкой, и пипеткой наливают на него раствор красителя. Длительность окрашивания различна: для водного фуксина 1-2 мин, метиленовой сини - 3-5 мин. По окончании окрашивания препарат берут за конец стекла, держат в наклонном положении смывают краску, направляя тонкую струю воды на ребро предметного стекла. Промывают до тех пор, пока стекающая вода станет почти неокрашенной. Затем препарат высушивают на воздухе или при помощи полоски фильтровальной бумаги, которую осторожно прикладывают к стеклу. Микроскопируют окрашенный мазок, применяя иммерсионный объектив 90. В тщательно приготовленном и правильно окрашенном препарате поле зрения остается чистым, окрашиваются только клетки микроорганизмов.

Окрашивание бактерий по Граму. Метод предложен датским ученым Грамом в 1884 г. На фиксированные мазки наливают карболовый генциан фиолетовый и окрашивают 1-2 мин. Краситель сливают, и, не промывая водой, мазок обрабатывают 1—2 мин раствором Люголя до полного почернения. По окончании обработки раствор Люголя сливают и на мазок наливают 96%-ный этиловый спирт на 0,5-1 мин. Слегка покачивая стекло, спирт меняют несколько раз. Чтобы исключить излишнее обесцвечивание клеток, к спирту добавляют йод (2 мл 10%-ного спиртового раствора йода на 100 мл этанола). Препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 1-2 мин йодным фуксином. Краситель сливают, препарат вновь промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный цвет фуксина.