Диагностические технологии на базе ПЦР

В зависимости от природы праймера (специфичный, полуспецифичный, произвольный) и способа идентификации продуктов амплификации различают несколько методов и маркеров ПЦР-анализа.

Наиболее широко используются молекулярные маркеры, которые применяют для определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации, картирования генома животных, человека, растений и микроорганизмов.

К числу таких маркеров относятся RAPD-маркеры и микросателлиты.

Микросателлиты (или простые короткие повторы) — варьирующие участки ДНК, состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований^[1].. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями.

RAPD-маркеры – random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR –случайно амплифицированная полиморфная ДНК).

Использование RAPD-маркеров позволяет амплифицировать ДНК из любого участка генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной нуклеотидной последовательностью.

Используют стандартные наборы праймеров – случайные (произвольные) праймеры. Использование олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР.

В этом случае используется, как правило, только один праймер и амплифицируются участки между этим праймером и его обратной (инвертированной) последовательностью. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках – инвертированных повторах (ип). Т.е., продукты RAPD-ПЦР представляют собой анонимную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами разной длины. Их выявляют гель-электрофорезом (как присутствие или отсутствие отдельной RAPD-полосы) RAPD-маркеры являются высокоинформативной характеристикой для оценки генетического разнообразия и родства.

5) Поиск гомологичных генов

Гомологичные гены – это гены, кодирующие ферменты различного строения, но со сходными функциями.

Во всех живых организмах протекают сходные биохимические процессы, катализируемые ферментами, которые ускоряют идентичные химические реакции. Например, как у растений, так и у животных функционирует цикл трикарбоновых кислот, реакции которого катализируют ферменты. Структура этих ферментов у разных организмов может различаться, однако выполняемые ими функции сходны. Такие ферменты, играющие одинаковую роль в метаболизме разных организмов, называют гомологичными.

Несмотря на то, что структура гомологичных белков может варьироваться, они имеют высококонсервативные участки, входящие в состав каталитических центров. По аналогии с белками существуют консервативные

последовательности и в генах.

Если создать праймеры, комплементарные таким консервативным последовательностям, то с помощью ПЦР можно найти гомологичный ген в организме, в котором наличие этого гена неизвестно.

В случае если гомологичный ген в исследуемом организме действительно существует, происходит отжиг праймеров на молекуле ДНК организма. Затем этот участок ДНК, ограниченный праймерами, амплифицируется. Так, выделив какой-то ген, скажем, из мыши, можно узнать, есть ли подобный ген, а, следовательно, фермент и биохимическая реакция у человека.

6) Идентификация маркерных генов

Каждый организм имеет уникальные, свойственные только ему гены или другие участки ДНК. Такие последовательности являются маркерными для организма. Если определить наличие маркерного участка, то можно однозначно диагностировать организм. ПЦР позволяет идентифицировать такие маркерные участки генома. В основе лежит все тот же принцип комплементарности праймеров маркерным фрагментам. Если ПЦР имеет положительный результат, значит, маркеры идентифицированы. Следовательно, определен и вид организма. Этот факт имеет огромное значение в медицинской диагностике.

7) Применение ПЦР в медицинской диагностике

Полимеразная цепная реакция позволяет оперативно поставить диагноз многих заболеваний.

1) диагностика инфекционных заболеваний;

2) диагностика онкологических заболеваний:

– диагностика лейкемий и лимфом;

– диагностика рака груди;

3) диагностика генетических заболеваний;

4) идентификация личности:

– судебная медицина, криминалистика;

– трансплантация органов и тканей;

– определение отцовства;