Структура жидкостного бассейна организма и осморегуляция на клеточном уровне

Вся эволюция живых организмов проходила в борьбе за сохранение стабильности осмотической концентрации и ионного равновесия внутренней среды. Уже на самых ранних этапах развития первичные формы жизни, зародившиеся в тёплых солёных водах древнего океана, вынуждены были выработать приспособление, позволяющее им регулировать ионный состав протоплазмы и движение воды в клетку и из неё.

На клеточном уровне таким приспособлением стала плазматическая мембрана, снабжённая миниатюрными биохимическими ионными насосами.

С образованием внутренней среды осмотическая и ионная регуляция ещё более усложнились. К местным клеточным механизмам присоединились сложные рефлекторные системы, охраняющие постоянство ионной и осмотической концентрации внеклеточной жидкости.

Взяв на себя заботу сохранения стабильности состава внеклеточной жидкости, рефлекторные механизмы значительно облегчили работу клеточных регуляторов, однако не заменили их. В связи с этим в организме высших млекопитающих система регуляции ионного и осмотического равновесия подобно многим другим гомеостатическим системам устроена по типу многоэтажного здания, в фундаменте которого лежит более древняя клеточная регуляция, над которой надстраиваются всё более и более усложняющиеся нейрогормональные рефлекторные механизмы.

Рассмотрение всей этой сложной системы уместно будет начать с общего обзора современных представлений о распределении воды и солей в организме.

Со времени Шаде(Schade,1928) принято всю жидкость, находящуюся в организме, распределять по трём пространствам или секторам.

Такая трёхкамерная система, хотя и упрощает существующие отношения, весьма удобна для анализа движения воды и солей, а также регуляции этих перемещений.

Общее содержание воды в теле человека, вычисленное по распределению тяжёлой воды (так называемое дейтериевое, или тритиевое, пространство), у мужчин составляет в среднем 61, 1 % веса тела, у молодых женщин -51, 1% [Керпель-Фрониус, 1964;Tisavipat e.a.1974].

Значительные колебания (от 54 до 70% у мужчин и от 46 до 60 % у женщин) объясняются не столько неточностью и разнообразием методов определения, сколько различным содержанием жира в организме испытуемых. Если исключить из расчётов вес жира в организме, то относительное содержание воды становится удивительно постоянным, равным 70-73% веса тела (независимо от пола).

Вся жидкость тела распределена в трёх пространствах: циркуляторном, интерстициальном и внутриклеточном. Для удобства рассуждения циркуляторный и интерстициальный объёмы часто объединяют и тогда получаются два пространства – вне- и внутриклеточное.

Объём внеклеточного сектора определяют различными путями, но наиболее совершенным является метод с применением меченого Cl ³⁸ , позволяющий измерить так называемое «хлорное пространство».

Считается. Что хлор не проникает в клетки и потому равномерно распределяется только во внеклеточной жидкости. По степени его разведения можно судить об объёме жидкости внеклеточного сектора, который в этом случае оказывается равным 26, 5 % веса тела.

Иные результаты получаются при применении в качестве индикатора вместо Cl ³⁸ ин4улина или маннитола.

Определённая таким способом величина внеклеточного пространства составляет 15-20 5 веса тела. Различие объясняется тем, что инулин легко распространяется только в свободной воде внеклеточного пространства и плохо проникает в воду, связанную с элементами соединительной ткани. С его помощью удаётся определить объём свободной воды, т.е. крови и лимфы.

Используя индикатор. Не выходящий за пределы кровяного русла, можно определить объём крови. Обычно для этого применяются синька Эванса (Т-1824) или альбумин(I¹³¹).

Синька Эванса связывается с белками крови, и долгое время сохраняется в кровяном русле. По степени её разведения определяется объём плазмы крови, который равен 5% веса тела (без учёта веса жира -6%). Вычитание этой величины из общего объёма внеклеточной жидкости(26, 5%) позволяет вычислить объём интерстициального пространства, равный 21, 5% веса тела (обычно эту величину округляют до 20 %). Исходя из данных о распределении хлора и инулина, следует признать, что половина воды интерстициального пространства находится в связанном состоянии и половина – в свободном. Эта последняя представлена главным образом лимфой.

Нам остаётся рассмотреть третий, самый большой, жидкостный сектор тела – внутриклеточный. Его объём равняется примерно 36, 1 %. Определяют этот объём путём вычитания из общего содержания воды в теле объёма «хлорного пространства»(61, 1%-25%=36,1%).

Итак, всю воду, содержащуюся в теле, можно разделить на три пространства: внутриклеточную воду(36, 1%), интерстициальную (свободную и связанную, 20%) и внутрисосудистую(5%). Интерстициальный и внутрисосудистый объёмы отделяются друг от друга капиллярной системой, обладающей диализирующими свойствами, исключающими возникновение осмотических сил. Внутриклеточный же и интерстициальный секторы разделяются клеточной мембраной, обладающей избирательной проницаемостью и молекулярными механизмами, обеспечивающими ионно-осмотическую регуляцию внутренней среды клеток.

Для рассматриваемой нами проблемы чрезвычайно важно знать ионный состав отдельных жидкостных секторов организма. От содержания ионов и их перемещения зависит возникновение осмотических сил и движение воды из одного пространства в другое. Соотношение ионных концентраций определяет ионное равновесие в жидкостях организма.

Рис.1. Ионограмма. Распрелделение катионов и анионов в жидкостных секторах организма [Gamble, 1952].

I-интерстициальная, II –внутриклеточная жидкость: 1-катионы, 2-анионы,3-общее количество.

На рис.1 приведена ионограмма, заимствованная нами[Gamble, 1952]. Основным катионом плазмы является натрий, основным анионом – хлор. На долю калия. Магния и кальция, так же как и на долю органических анионов –SO₄ и –HPO₄, приходится лишь небольшая часть общей концентрации. Такой же состав имеет и жидкость интерстициального пространства. В ней также основным катионом является натрий, а анионом – хлор. Оба сектора изоосмотичны друг другу.

Иначе обстоит дело с внутриклеточной жидкостью. В ней главным катионом является - К⁺, а главными анионами–HPO₄^2-_,–SO₄ и органические кислоты. Именно здесь и обнаруживается роль клеточных плазматических мембран, которые создают столь существенное различие в ионном составе. Они как бы разделяют внутриклеточное пространство на бесчисленное множество изолированных ячеек, обеспечивая особенность его состава по сравнению с внеклеточной жидкостью.

после описания распределения жидкости в организме мы можем перейти к рассмотрению механизмов клеточной осмо-ионной регуляции. В этой проблеме весьма важным, но, к сожадлению, ещё недостаточно выясненным остаётся вопрос об изоосмотичности жидкости вне- и внутриклеточного пространства. По мнению некоторых исследователей[Robinson, 1950, 1953], внутриклеточная жидкость гипертонична по сравнению с внеклеточной, по мнению других [Русняк и др.,1957; Керпель-Фрониус, 1964] – обе жидкости изоосмотичны и, следовательно, перед клеткой не возникает осморегуляторных проблем. Как бы то ни было, между внутри- и внеклеточным пространством существуют сложные физико-химические отношения, зависящие от особенностей строения этих двух пространств и различного их ионного состава.

Основным и единственным приспособлением, обеспечивающим осмотическую и ионную регуляцию внутриклеточной среды, является клеточная плазматическая мембрана. Обладая молекулярными механизмами, обеспечивающими прохождение одних ионов, и препятствующими движению других, мембрана решает сразу три основные биологические проблемы клетки. Она сохраняет постоянство её ионного состава, осмолярность цитоплазмы и обеспечивает возникновение основного физиологического процесса – возбуждения.

В настоящее время структура мембраны хорошо изучена. Предложен ряд моделей, отличающихся друг от друга расположением белковых и фосфолипидных молекул, гидрофильными и гидрофобными связями, устройством ионных каналов, конструкцией примембранных структур [Поликар, 1972; Лев, 1975; Комиссарчик, 1975; Ходоров, 1975; Левин, 1976; Лишко, 1977; Веренинов, 1978].

Для обсуждаемой проблемы наибольший интерес представляют механизмы, регулирующие прохождение через мембрану ионов. Мембрана хорошо проницаема для калия и хуже для натрия, тем не менее, ионы вполне могли бы равномерно распределиться во внутри- и внеклеточной среде. Однако этого не происходит. Натрий концентрируется снаружи, а калий – внутри клетки. Соответственно натрий так и называется внеклеточным катионом, а калий – внутриклеточным. Каковы же причины, вызывающие именно такое распределение ионов?

Прежде всего, что заставляет калий удерживаться внутри клеток? Подчиняясь концентрационному градиенту, калий стремится покинуть цитоплазму и, поскольку мембрана для него проницаема, легко выходит на её наружную поверхность. Этот поток ионов, проходящий через специальные калиевые каналы, ограничивается положительным зарядом на наружной поверхности мембраны, работой активного ферментативного механизма – натрий-калиевого насоса и отрицательным зарядом, который возникает внутри клетки благодаря накоплению органических анионов, не способных пройти через мембрану.

Положительный заряд, создаваемый натрием и вышедшим из канала калием, постепенно уравновешивает силу концентрационного градиента и обеспечивает удержание калия в клетке. Кроме того, активно работающий натрий-калиевый насос засасывает часть вышедшего наружу калия обратно в клетку в обмен на натрий. Таким образом, пассивные и активные механизмы создают условия для накопления калия в клетке, несмотря на высокую калиевую проницаемость клеточной мембраны.

Подчиняясь концентрационному градиенту, натрий, напротив, через специальные натриевые каналы стремится проникнуть в клетку. Хотя мембрана для него малопроницаема, он мог бы накопиться в цитоплазме в достаточном количестве, тем более что этому способствует однонаправленность концентрационного и электрического градиентов. Однако клетка строго охраняет свою внутреннюю среду от вторжения в неё натрия. При этом она преследует две цели: с одной стороны, сохраняет поляризованность мембраны, её готовность к возбуждению, с другой - оберегает себя от вторжения в цитоплазму излишков воды, которая неизбежно последует за натрием. Механизм, ограничивающий поступление натрия в клетку, и есть то самое мембранное устройство, которое, как об этом говорилось выше, выполняет сразу несколько функций: обеспечивает ионную регуляцию, осморегуляцию и способность клетки возбуждаться.

Общепринятой в настоящее время является точка зрения, согласно которой натрий не накапливается в клетке благодаря постоянно функционирующему натрий-калиевому насосу. Этот насос (натриевая помпа) представлен конституционно связанной с мембраной(Na⁺-K⁺) АТФазой – ферментом, способным отщеплять от АТФ фосфорную кислоту и за счёт освобождающейся энергии осуществлять перенос ионов [Skou, 1965;Glynn,Karlich,1975]. Предполагается, что эта важнейшая для клетки реакция происходит следующим образом.

На первой стадии, для которой необходимо присутствие ионов натрия на внутренней стороне мембраны, концевая фосфатная группа АТФ переносится на молекулу фермента с образованием ковалентного промежуточного продукта (фосфорилированного фермента). Реакция может быть записана следующим образом:

Na⁺_B+АТФ+E→[Na⁺∙Е~ Ф]+АДФ.

Во второй стадии комплекс Na⁺∙Е~ Ф гидролизуется с образованием свободного фермента и фосфорной кислоты. Реакция протекает в присутствии калия на наружной поверхности мембраны. При распаде комплекса Na⁺ высвобождается и уходит на наружную поверхность мембраны, а калий переходит внутрь клетки:

Na⁺∙Е~ Ф.+К_Н.→Na⁺_Н+К⁺_В+Ф.+Е.

Первая стадия тормозится ионами Са²⁺, но на неё не действует классический ингибитор натрий-калиевого насоса – уабаин. Вторая протекает только в присутствии ионов К⁺ или Н⁺ и ингибируется уабаином, который конкурирует с ионами К⁺. при прочих равных условиях активность(Nа⁺ - К⁺) АТФазы зависит от содержания Mg²⁺ в среде, который входит в состав субстрата гидролиза АТФ (Mg²⁺-АТФ).

Благодаря работе АТФазного насоса, натрий, вторгающийся в клетку, эффективно из неё удаляется, и таким образом обеспечивается соответствующее распределение ионов внутри и снаружи клеток.

Перемещение ионов неизбежно должно привлечь за собой передвижение воды, поскольку в организме всегда соблюдается принцип тесной связи между этими двумя веществами. Особенно значительную роль играет ион натрия. Обладая высокой гидрофильностью и находясь в большом количестве во внеклеточной жидкости, натрий обеспечивает передвижение воды между всеми жидкостными секторами тела.

Передвижение воды R1/2 между клеткой и внеклеточным пространством может рассматриваться как местная клеточная саморегуляция, и поскольку этот процесс является своего рода первым этапом осморегуляции вообще, в том числе и на уровне организма, на нём следует остановиться подробнее.

Клетки контактируют не со свободным водно-солевым раствором, который в интерстициальном пространстве содержится только интраваскулярно [Русняк и др., 1957], а со сложно устроенной системой соединительной ткани.

В этой системе, состоящей из клеточных элементов, волокнистых структур и основного вещества, для нас наибольший интерес представляет межуточное вещество, поскольку именно оно играет ведущую роль в водно-электролитном обмене между клетками и кровью. Межуточное вещество обладает удивительной способностью беспрепятственно транспортировать воду, соли, газы и органические вещества к клеткам и от них. Поскольку мембрана капилляра легко проницаема для воды и солей, поступление этих веществ в интерстиций практическ не ограничивается. По этой причине плазма крови, лимыфа ми межуточный коллоид отличаются друг от друга только органическими компонентами, сохраняя полнубю тождественность водно-электролитного состава.

Клеточная мембрана непосредственно контактирует с весьма лабильным коллоидом межуточного вещества, осмолярность и ионный состав которого определяет водно-электролитный обмен клеток. В свою очередь, содержание воды и солей в коллоиде зависит от того, что в него поставляет плазма крови, выделяют клетки, резорбируют лимфатические и кровеносные капилляры. Большое влияние на содержание воды и солей оказывает физико-химическое состояние коллоида, которое, в свою очередь, зависит от поступающих в него ионов, поскольку последние являются стабилизаторами коллоидных растворов.

Между этим коллоидом, представляющим собой сложную физико-химическую систему, и клеточной цитоплазмой происходит процесс, который может быть обозначен как водно-электролитный обмен на клеточном уровне. Именно здесь и осуществляют свою функцию механизмы клеточной осморегуляции.

Существование таких механизмов у одноклеточных животных не вызывает сомнения [Рубинштейн, 1947; Коштоянц, 1950; Проссер, 1977].

Другое дело – многоклеточные и особенно высшие животные, клетки которых лишены непосредственного контакта с внешней средой и находятся в осмотически стабильной внутренней среде организма.

Считается, что вода свободно передвигается из одного жидкостного сектора в другой, выравнивая, таким образом, возникающие осмотические градиенты. Хорошо проницаема для неё и клеточная плазматическая мембрана, в связи, с чем содержание воды в клетке полностью зависит от эффективной¹ осмотической концентрации жидкостей внеклеточного сектора. Неоднократно было показано, что изменение осмолярности крови и интерстициальной жидкости ведёт к перераспределению воды между внутри- и внеклеточным пространством в строгом соответствии с законами осмоса. При внутривенном введении гипертонических растворов различных веществ, особенно не способных проникать через эндотелий капилляров, объём внутриклеточного пространства уменьшался в связи с потерей воды. В условиях увеличения осмолярности внутриклеточного сектора, например, при подавлении клеточного дыхания и появлении в протоплазме различных метаболитов, вода перемещается из интерстиция в клетку.

Наряду с представлением о пассивном перемещении воды высказывалось предположение и об её активном транспорте.

В своё время было показано, что при перемещении ткани в среду, изоосмотичную плазме крови (например, в физиологическтй раствор), клетки её набухают тем интенсивнее, чем значительнее подавляется их дыхание. Искусственное торможение или разобщение окислительного процесса вызывало набухание клеток даже в среде, осмолярность которой соответствовала осмолярности плазмы крови или тканевой жидкости.

[1]

Таблица 1. Средняя величина поглощения кислорода срезами различных органов на миллиграмм сухого веса тканей за 90 мин, мкл

Объект исследования	Изотоническая среда	Гипотоническая среда
Срезы почки	14,0±1,6	18,0±1,8
Срезы печени	7,1±0,4	7,7±0,6
Мышца диафрагмы	8,1±0,3	7,7±0,2

На основании этих фактов[Robinson,1950,1953] была сформулировала гипотеза, согласно которой клетки обладают специальным механизмом, активно выкачивающим воду, вторгающуюся в их гиперосмотичную по отношению УК интерстициальной жидкости протоплазму. Для работы этого механизма требуется постоянный приток энергии, которая поставляется окислительным конвейером. Вот почему при подавлении дыхания активный транспорт воды через плазматическую мембрану тормозится клетка набухает.

Мы также смогли убедиться в связи между окислительным процессом и набуханием клеток [Финкинштейн,1959].при помещении срезов почек, печени и диафрагмы крысы в гипотоническую среду (кребс-рингер, наполовину разведённый дистиллированной водой) в аппарате Варбурга наблюдалось усиление поглощения кислорода (табл. 1).

Наиболее активизировалось дыхание в почечных срезах(на 24% по сравнению с исходным), меньше –в срезах печени(на 8%) и совсем не увеличивалось, даже несколько уменьшалось(на 5%), в срезах диафрагмы.

По-видимому, усиление дыхания был связано с увеличением энергетических затрат клеточных механизмов, обеспечивающих эвакуацию воды из цитоплазмы и препятствующих таким путём её набуханию. Это предположение нашло подтверждение в опытах с помещением срезов в гипотоническую среду и подавлением их дыхания путём заполнения сосудиков аппарата Варбурга азотом. В таких условиях наиболее интенсивно набухали срезы почки, затем печени и совсем не набухали срезы диафрагмы.

Казалось бы, наши результаты подтверждают гипотезу Робинсона. Однако поиски ферментативных биохимических механизмов, способных активно транспортировать воду, не привели к успеху. В то же время были обнаружены и хорошо изучены механизмы транспорта натрия, также нуждающиеся в притоке энергии. В настоящее время достаточно установлено, что натриевый насос оберегает клетку не только от нарушения ионного состава, но и от вторжения в неё воды. При различных нарушениях клеточного дыхания неизбежно расстраивается работа натриевого насоса; натрий поступает в клетку, увлекая за собой воду, и вызывает набухание цитоплазмы даже в изотонической среде.

По мнению Корта и Кляйнцеллера[Cort,Kleinzeller,1956], натриевый механизм не единственный, способный изменить гидрофильность клеточной цитоплазмы; при различных нарушениях обмена, в том числе и при угнетении дыхания, часть ионов, связанных с белками цитоплазмы(20-30%), могут освобождаться, увеличивая тем самым её осмотическую концентрацию и вызывая набухание клетки.

Ионный механизм регуляции осмолярности и объёма клетки имеет большое значение при её возбуждении. В этом случае, в связи сдеполяризацией клеточной мембраны, тормозится натриевый насос и внутрь устремляется поток натрия. Несмотря на то, что эта реакция кратковременна и количество проникающих катионов невелико, можно думать, что они всё же увлекают за собой определённый объём воды. Кроме того, при возбуждении в цитоплазме появляется много осмотически активных веществ, также способных задерживать воду. Если дело обстоит именно так, то при каждом возбуждении клетка должна немного набухать, а в период покоя освобождаться от воды. Такое явление имеет место в клетках скелетных мышц, сердечной мышце и железистых клетках. Если возбуждение возникает слишком часто, превосходя по частоте лабильность клетки, то развивается парабиотическое состояние, при котором в цитоплазме накапливается натрий и задерживается вода.

Видимо, этот механизм лежит в основе набухания клеток при перевозбуждении. Не исключено, что его нарушение является причиной внутриклеточного отёка, возникающего при некоторых патологических состояниях.

Итак, большинством исследователей признаётся существование процесса осморегуляции на уровне клетки. Отрицается лишь гипотеза Робинсона об активных механизмах, транспортирующих воду, и принимается положение, сформулированное в своё время А.Г.Гинецинским(1963), о пассивном передвижении воды вслед за активно транспортируемыми ионами.

Клеточные механизмы ионно-осмотической регуляции имеют ограниченные возможности. Они эффективны только в условиях достаточно стабильной окружающей среды. Поддержание её постоянства обеспечивается сложными рефлекторными механизмами, являющимися более совершенными регуляторными устройствами следующего этажа, выполняющими функции сохранения осмотического постоянства внутренней среды организма.

К рассмотрению строения и функции этих механизмов мы далее и переходим.
Глава 2.