Определение состава фосфатидилхолина

Идентификация холина. При кипячении лецитина в растворе гидроксида натрия ощущается запах селедочного рассола, характерный для триметиламина (N[CH₃]₃), который образуется из холина при нагревании. Триметиламин обнаруживается также по посинению (щелочная реакция) влажной лакмусовой бумажки, если ее подержать над кипящим раствором.

Идентификация жирных кислот. Натриевые соли жирных кислот (растворимы в воде) в кислой среде, например при подкислении ее соляной кислотой, переходят в свободные жирные кислоты (нерастворимые в воде), всплывающие на поверхность раствора.

Идентификация глицерина. Используется акролеиновая проба, уже рассмотренная в предыдущей лабораторной работе.

Идентификация фосфора. Обнаружение фосфорной кислоты в фосфолипидах можно осуществить с использованием молибдата аммония или магнезиальной смеси.

1. Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:

H₃PO₄ + 12 (NH₄)₂MoO₄ + 21 HNO₃ →
(NH₄)₃PO₄ × 12 MoO₃ + 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O

2. Реакция с магнезиальной смесью основана на образовании кристаллического осадка фосфата магний-аммония MgNH₄PO₄ в ходе двух последовательных реакций: образования фосфата аммония (при подкислении образца аммиаком) и взаимодействия данной соли со смесью хлорида магния и хлорида аммония.

Контрольные вопросы

1. Строение и свойства глицерофосфолипидов. Фосфатидная кислота.

2. Строение и свойства фосфатидилхолина (лецитина) и фосфатидил­этанол­амина (кефалина).

3. Строение и свойства фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола и кардио­липина. Лизофосфолипиды.

4. Строение и свойства сфингофосфолипиидов. Сфингомиелины. Сфингозин и ди­гид­росфингозин. Церамиды.

5. Строение и свойства гликолипидов. Биологическая роль гликолипидов.

6. Строение и свойства цереброзидов и сульфатидов.

7. Строение и свойства ганглиозидов.

8. Определение состава и свойств фосфолипидов.

9. Опыт по выделению лецитина из яичного желтка.

Литература

1. Страйер Л. Биохимия, т. 1, 2, 3. – М.: Мир, 1985.

2. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1987.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека,
т. 1, 2. – М.: Мир, 1993.

4. Горячковский А.М. Справочное пособие по клинической биохимии. – Одесса: ОКФА, 1994.

5. Евстигнеева Р.П., Серебренникова Г.А., Звонкова Е.Н., Филиппович Е.И., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.И., Скляр Ю.Е. Химия биологически активных природных соединений / Под ред. Преображенского Н.А. – М.: Химия, 1976.

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1998.

7. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000.

8. Зайчик А.Щ., Чурилов Л.П. Основы патохимии. – СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2000.

9. Чиркин А.А. Практикум по биохимии. – Мн.: Новое знание, 2002.

Ход работы

Тема: Фосфолипиды

w Выделение лецитина (фосфатидилхолина) из яичного желтка

1. Желток вареного яйца тщательно растирают в ступке с добав­ле­нием 40 мл эфира.

Примечание: Осторожно! Следует удостовериться в отсутст ­ вии в кабинете работающих горелок и других источников открытого пламени.

2. Полученный экстракт фильтруют с использованием складчатого фильтра.

3. Для полноты экстракции остаток желтка в ступке дважды промывают порциями эфира по 5 мл, сливая их на фильтр.

4. Фильтрат переносят в фарфоровую чашку и выпаривают досуха на водяной бане.

Примечание: Осторожно! Следует работать в вытяжном шкафу. Горелку не использовать.

5. Полученный сухой остаток, содержащий смесь фосфолипидов и жиров, тщательно обрабатывают дважды кипящим этиловым спиртом отдельными порциями по 8 мл.

6. Спиртовые вытяжки охлаждают и фильтруют через сухой фильтр в фарфоровую чашку для отделения жиров. Триацилглицеролы, в отличие от лецитина, плохо растворяются в холодном этиловом
спирте.

Примечание: Фильтрат должен быть прозрачным.

7. Аликвоту прозрачного фильтрата в объеме 2 мл переносят в отдельную пробирку.

8. Этиловый спирт из оставшегося фильтрата выпаривают на водяной бане и получают «сырой» (неочищенный) лецитин.

9. Полученные таким образом препарат лецитина (п. 8) и его спиртовой раствор (п.7) используют в дальнейших опытах.

Тема: Физико-химические свойства фосфолипидов

w Осаждение фосфолипидов ацетоном

1. Третью часть полученного лецитина (по массе) снова растворяют в 3 мл эфира.

2. К полученному раствору при помешивании добавляют 10 мл ацетона.

3. После осаждения лецитина ацетоном надосадочную жидкость осторожно сливают.

4. Взвесь осадка лецитина (3 капли) переносят на предметное стекло, дают ацетону испариться, наносят на то же место еще 3 капли и после испарения ацетона добавляют каплю воды.

5. С помощью микроскопа наблюдают образование на покровном стекле «миелиновых» фигур в виде длинных закрученных нитей с утолщениями на концах.

6. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Эмульгирование фосфолипидов

1. К 2 мл спиртового раствора лецитина добавляют по каплям воду и смесь сильно встряхивают.

2. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Осаждение лецитина (фосфатидилхолина) хлористым кад­мием

1. К 2 мл спиртового раствора лецитина добавляют 1 мл насыщенного спиртового раствора хлористого кадмия и смесь сильно встряхивают.

2. Объясняют полученный результат и делают выводы.

Тема: Изучение химического состава фосфолипидов

w Гидролиз фосфолипидов (лецитина)

1. Остаток лецитина переносят в пробирку и добавляют 5 мл 10%‑ного раствора гидроксида натрия.

2. Лецитин гидролизуют (получая смесь холина, жирных кислот, глицерина и фосфорной кислоты) кипячением в течение 10 мин.

w Обнаружение холина

1. Отмечают появление запаха селедочного рассола при гидролизе лецитина.

2. Отмечают изменение цвета влажной лакмусовой бумажки, если ее подержать над кипящей смесью.

3. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Обнаружение жирных кислот

1. В гидролизат фосфатидилхолина вносят 10%-ный раствор соляной кислоты до покраснения лакмусовой бумажки (кислая среда).

2. Всплывшие на поверхность жирные кислоты отфильтровывают (фильтрат используют в следующем опыте).

3. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Обнаружение глицерина

1. К фильтрату (см. предыдущую стадию) по каплям добавляют
10%-ный раствор гидроксида натрия до нейтральной по лакмусу реакции.

2. Затем фильтрат выпаривают досуха на водяной бане.

3. Присутствие в остатке (берут 1/3 остатка по массе) глицерина определяют с использованием акролеиновой пробы (см. лабо­ра­тор­ную работу №10).

4. Объясняют полученный результат и делают выводы.

w Открытие фосфора

Приготовление образца:

1. Оставшуюся часть сухого остатка, полученного на предыдущей стадии эксперимента, переносят в фарфоровый тигель и тщательно смешивают с трехкратным количеством смеси, содержащей 2 части карбоната натрия и 1 часть нитрата калия.

2. Тигель прикрывают крышкой и осторожно нагревают.

Примечание: Осторожно! Реакция идет бурно, иногда сопровождается небольшой вспышкой!

3. Полученный сплав осторожно прокаливают до полного окисления. После этого тигель охлаждают.

4. Полученную серовато-бурую золу растворяют в 10%-ном растворе азотной кислоты (кислоту добавляют по каплям, растирая золу стеклянной палочкой).

5. С полученным раствором проводят реакции на обнаружение фосфорной кислоты.

w Реакция обнаружения фосфорной кислоты с молибдатом аммония

1. К 2 мл молибденового реактива (раствора молибдата аммония в азотной кислоте) добавляют 1 мл анализируемого раствора.

2. Смесь нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин.

3. Записывают и объясняют результаты.

w Реакция обнаружения фосфорной кислоты с магнезиальной смесью

1. К 1 мл анализируемого раствора постепенно добавляют концент­ри­ро­ванный раствор аммиака до появления резкого запаха.

2. Затем приливают равный объем магнезиальной смеси.

3. Растирают стеклянной палочкой.

4. Записывают и объясняют результаты.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические данные по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.