Лабораторная работа № 12

Тема:	1. Выделение нуклеопротеидов. Качественные реакции на присутствие компонентов нуклеопротеидов в растворе 2. Количественное определение нуклеиновых кислот
Цель работы:	Изучение и овладение методами идентификации и количественного определения нуклеиновых кислот в биологических препаратах

Оборудование и материалы:

· Спектрофотометр SOLAR

· Кюветы полистирольные

· Центрифуга К-24

· Весы центрифужные

· Пробирки центрифужные

· Водяная баня

· Плитка электрическая

· Колба круглодонная с обратным холодильником

· Ступка с пестиком

· Воронка стеклянная для фильтрации

· Пипетки стеклянные на 1 и 5 мл

· Микропипетки автоматические

· Пробирки химические

· Штативы для пробирок

· Цилиндры мерные на 50-250 мл

· Стеклянные палочки

· Фильтр бумажный

Реактивы:

· Дрожжи

· Эфир

· Песок

· NaOH, 0,4%-ный и 10%-ный растворы

· CH₃COOH, 5%-ный раствор

· H₂SO₄(конц.)

· H₂SO₄, 5%-ный раствор

· CuSO₄, 2%-ный раствор

· NH₄OH (конц.)

· Ag₂О, 1%-ный раствор в NH₄OH

· Тимол, 1%-ный спиртовой раствор

· Молибденовый реактив: молибдат аммония ([NH₄]₂MoO₄),
15%-ный раствор/HNO₃ (конц.) в cоотношении 110 / 90

· Реагенты для орцинового метода:

Раствор А. Орцин, 1%-ный раствор

Раствор Б. HCl(конц.)

Раствор В. FeCl₃ × 6H₂O, 10%-ный раствор

· Дифениламиновый реагент: дифениламин, 1,5%-ный раствор в CH₃COOH; H₂SO₄(конц.); CH₃CHO

· HСlO₄(конц.)

· РНК, стандартный раствор (100mг/мл)

· ДНК, стандартный раствор (50mг/мл)

· вода дистиллированная

Теоретическая часть

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты в той или иной степени были известны исследователям достаточно давно. Например, в 1847 г. немецкий химик Ю. Либих, иностранный член-корреспондент Петербургской академии наук, впервые выделил из мясного экстракта инозиновую кислоту (монофосфорный эфир нуклеозида инозина). В 1869 г. швейцарский врач Ф. Мишер, исследуя химический состав ядер лейкоцитов, выделил из них вещество, обладавшее кислыми свойствами, которое он назвал нуклеином. Это событие расценивают как открытие нуклеиновых кислот, хотя сам термин «нуклеиновая кислота» был введен лишь 30 лет спустя, в 1899 г. Немногим ранее, в 1891 г., немецкий биохимик Альбрехт Кëссель осуществил и описал гидролиз нуклеиновой кислоты и показал, что она состоит из остатков сахара, фосфорной кислоты и четырех гетероциклических оснований, являющихся производными пурина и пиримидина. Он же впервые доказал существование двух типов нуклеиновых кислот.

С начала XX в. началось интенсивное изучение продуктов расщепления нуклеиновых кислот. Большой вклад в химию пуринов и пиримидинов внес химик-органик Э. Фишер, а позднее в работах Ф. Левена и Д. Гулланда было дано описание строения углеводных компонентов и определена природа нуклеозидных звеньев в составе нуклеиновых кислот. Используемые и в настоящее время термины нуклеозид и нуклеотид были предложены Ф. Левеном еще в 1908–1909 гг. Окончательно химическое строение нуклеозидов и нуклеотидов, а также роль фосфодиэфирной связи в полимеризации мономерных звеньев нуклеиновых кислот были выяснены в 1952 г. английскими исследователями под руководством А. Тодда.

После открытия того факта, что нуклеиновые кислоты являются полимерами, состоящими из нуклеотидов четырех типов, с конца 30‑х гг. прошлого столетия утвердилось мнение, что полимер нуклеиновой кислоты представляет собой многократно повторяющиеся тетрануклеотиды, состоящие из всех четырех азотистых оснований. Эта теория, сформулированная Ф. Левеном, была опровергнута в 1950 г. Эрвином Чаргаффом с сотрудниками из Колумбийского университета. Чаргафф установил значительные различия в нуклеотидном составе ДНК из разных источников и сформулировал основные положения, характеризующие состав нуклеиновых кислот, которые получили название правил Чаргаффа.

Вершиной исследований строения нуклеиновых кислот явилась модель двойной спирали ДНК, предложенная в 1953 г. американским биохимиком и генетиком Дж. Уотсоном и английским физиком Ф. Криком. Эта дата официально считается моментом рождения новой отрасли биологической науки – молекулярной биологии. На основании модели ДНК была выдвинута гипотеза полукон ­ сер ­ вативного способа репликации данной молекулы, которая была подтверждена в 1957 г. после открытия Артуром Корнбергом фермента ДНК-поли ­ меразы.

Начало работам, приведшим к выяснению биологической роли РНК, было положено в 30-е гг. Т. Касперсоном и Ж. Браше, которые изучали содержание и распределение в клетке нуклеиновых кислот и, в первую очередь РНК. Значительно позже (в 50-х гг.) было показано, что синтез белка осуществляется рибосомами, но представления о существовании РНК-посредника (иРНК), переносящего инфор­мацию от ДНК к рибосомам, были сформулированы французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно только в 1961 г. Главный фермент транскрипции – ДНК-зависимая-РНК-полимераза – был открыт в 1960 г. С. Вейссом, Ж. Гурвицем и О. Стивенсом.

Таким образом, подводя итог этой краткой исторической справке и принимая во внимание современные представления о структуре и функции нуклеиновых кислот, можно сказать, что нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) являются важнейшими информационными макромолекулами клетки, которые с химической точки зрения представляют собой полимеры, построенные из многих тысяч и даже миллионов нуклеотидов, соединенных между собой 3^/-5^/-фосфодиэфирными связями. В зависимости от вида нуклеиновой кислоты различают дезоксирибонуклеотиды (содержат 2^/- дезокси-D-рибозу и входят в состав ДНК) и рибонуклеотиды (содержат D-рибозу и входят в состав РНК). Кроме того, в зависимости от химической природы азотистых оснований (пуриновые или пиримидиновые), входящих в состав нуклеотидов, их подразделяют на пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды соответственно. Следует иметь в виду, что биологическая роль нуклеотидов не ограничивается их участием в качестве мономеров в процессах биосинтеза ДНК и РНК. В частности, пуриновые рибонуклеотиды выполняют функции универсальных источников энергии (например, АТР и GTP), регуляторных сигналов (сАМР, сGMP), они входят в состав важнейших коферментов (FAD, NAD⁺, NADP⁺) и служат переносчиками метильных групп (S-аденозилметионин); пиримидиновые нуклеотиды функционируют в качестве макроэргических интермедиатов в углеводном обмене (UDP-глюкоза, UDP-галактоза) и в синтезе липидов (CDP-ацилглицерол).

Компоненты нуклеиновых кислот

Структура пиримидиновых и пуриновых оснований

Пиримидиновые и пуриновые азотистые основания, входящие в состав нуклеотидов, представляют собой замещенные производные шестичленного гетероцикла – пиримидина, с одной стороны, и пурина – сложной гетероциклической системы, состоящей из двух конденсированных гетероциклов: пиримидина и имидазола, – с другой стороны (рис. 12.1).

Рис. 12.1. Структурные формулы пиримидина и пурина – исходных соединений пиримидиновых и пуриновых оснований нуклеиновых
кислот

Положения атомов в ароматических кольцах пронумерованы в соответствии с принятой номенклатурой. Следует обратить внимание на то, что нумерация в пиримидиновом и пуриновом кольцах идет в противоположных направлениях, при этом атом углерода С₅ в обеих молекулах находится в одном и том же положении.