Твердофазный иммуноферментный анализ

Принцип состоит в формировании комплекса, напоминающего собой «слоеный пирог», в котором определяемое вещество составляет одни из внутренних слоев, а индикаторный фермент — самый внешний.

Определение выполняют в лунках, стенки которых изготовлены из специального синтетического материала, эффективно адсорбирующего антитела — полистирена.

Сначала в лунки вносят первичные антитела против определяемого вещества, а затем после их адсорбции на стенках и удаления избытка — исследуемую пробу, содержащую определяемое вещество.

Оно с помощью первичных антител фиксируется на стенках лунки. После этого добавляют вторичные антитела, фиксирующиеся на тех же молекулах определяемого вещества, которые другими группировками адсорбированы на первичных антителах (ELISA — метод двойных антител).

Четвертый слой иммунного «пирога» - фермент пероксидаза, фиксированный на антителах, связывающихся со вторичными антителами. При этом количество фиксированной пероксидазы оказывается прямо пропорциональным содержанию определяемого вещества в исследуемой пробе. После добавления каждого реагента и завершения реакции связывания избыток непрореагировавших белков тщательно удаляют отмыванием буферным раствором.

На конечном этапе определения проводят ферментативную реакцию. В лунку добавляют о-фенилендиамин или тетраметилбензидин и перекись водорода. Благодаря присутствующей пероксидазе о-фенилендиамин окисляется и через некоторое время интенсивность окраски измеряется фотометрически.

Учебная практика семестр 3