2015-04-30
8128
Метод основан на измерении интенсивности окраски, которую дает раствор белка в цветных реакциях: биуретовой и реакции Фолина.
При взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса образуются комплексные соединения (биуретовая реакция), которые своими тирозиновыми и цистеиновыми радикалами восстанавливают смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот с образованием комплексного соединения синего цвета (реакция Фолина). Интенсивность окраски комплекса, которая зависит от количества белка в исследуемой пробе, измеряется на фотоэлектроколориметре с красным фильтром. В работе используются следующие реактивы:
А – 2% раствор Na2CO3 0,1N NaOH
В – 0,5% раствор СuSO4*5H2O в 1% растворе винно-кислого среднего Na,K.
С – щелочной раствор меди, полученный сливанием 50 мл реактива А и 1 мл реактива В (в день определения).
Е – реактив Фолина (приготовленный разводят в 2 раза). Для приготовления реактива Фолина 100 г Na2WO4*2H2O и 25 г Na2MoO4*2H2O растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл соляной кислоты (конц.). Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 часов. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Не пользуясь более обратным холодильником, кипятят содержимое колбы в течение 15 минут для удаления избытка брома (под тягой). Раствор охлаждают, доводят водой до объема 1 л и фильтруют через стеклянный фильтр.
|
|
|
Хранят реактив Фолина в склянке из темного стекла.
Построение калибровочного графика: Чтобы определить содержание белка в исследуемой пробе, необходимо построить калибровочный график. Для построения калибровочного графика используют ряд растворов бычьего альбумина с известными концентрациями. Для этого берут 10 мг альбумина растворяют в 10 мл воды из этого раствора берут 2 мл и доводят водой до 10 мл, концентрация полученного исходного раствора белка – 200 мг/мл. Из этого раствора готовят разбавленные растворы. Для этого наливают в пробирку указанное в таблице количество белка и воды.
К 1 мл каждого разбавленного раствора добавляют 5 мл реактива С. Смесь перемешивают и через 10 минут приливают к ней 0,5 мл раствора Е. Через 30 минут измеряют оптическую плотность каждого раствора на ФЭКе с красным светофильтром и строят калибровочный график, откладывая по горизонтальной оси (абсциссе) известные концентрации, а по вертикальной оси (ординате) соответственно значения оптической плотности (рис.2).
 |
Рис.2. Калибровочный график, построенный по стандартным раствором белка
|
|
|
Приготовление разбавленных растворов
| № пробирки | Концентрация р-ра белка (мкг в 1 мл) | Кол-во исходного р-ра белка в мл | Кол-во H2Oв мл |
| 0.2 | 0.8 | ||
| 0.3 | 0.7 | ||
| 0.4 | 0.6 | ||
| 0.5 | 0.5 | ||
| 0.6 | 0.4 | ||
| 0.7 | 0.3 | ||
| 0.8 | 0.2 |
Ход работы: 
Для определения концентрации белка к 1 мл исследуемого раствора белка добавляют реактивы С и Е в таком же количестве и порядке, как и при построении калибровочной кривой и находят оптическую плотность этого раствора. Найденную величину оптической плотности исследуемого раствора белка откладывают на оси ординат и проводят прямую линию параллельно оси абсцисс до пересечения с калибровочной кривой. Из точки пересечения проводят линию параллельно оси ординат. В точке пересечения с осью абсцисс находят концентрацию белка, соответствующую данной оптической плотности раствора.
