Очистка pDNA равновесным центрифугированием в CsCl

Адаптированная методика для центрифуги Optima TL-100 (Beckman). Используется бакет-ротор, пробирки запаивать не нужно. Удобна, когда требуется не слишком большое количество (до 1mg) pDNA высокого качества.

Растворы.

· p1,p2,p3

· Изопропанол/CsCl

Комментарии.

· Общие.

· По пунктам.

1. взять 0.2-1.0mg pDNA, довести объём до 540µl (H2O или TE),

2. добавить

· 0.800g CsCl;

· 60µl EtBr 10mg/ml;

3. смешать, NT, 5';

4. ЦФ NT, 10';

5. перенести водную фазу в полипропиленовую ультроцентрифужную пробирку для ротора TLS-55; наслоить поверх последовательно по 0.73ml растворов "p2" и "p1";

6. уравновесить пробирки (вместе с бакетами) попарно на точных весах (с точностью до 1mg);

7. ЦФ на Optima TL-100 (Beckman) 55krpm, NT, >12h (лучше ~24h);

8. собрать в 1-2ml шприц суперскрученную pDNA (нижняя полоса), перенести в 1.5ml пробирку;

9. несколько раз (до исчезновения окраски) экстрагировать раствором "изопропанол /CsCl";

10. очистка от CsCl:

· либо диализ,

· либо разбавить H2O в 3 (а лучше в 6) раз и осадить 1х объёмом EtOH (мягко смешать, преципитат промыть 75% EtOH, дважды перенося типом в новую пробирку);

11. подсушить, растворить в H2O или TE, спектрофотометрически определить концентрацию.