Полная ферментационная культура

(1500 л, 8,3 мкг/мл γ1 и 7мкг/мл δ1))

EtOAc (1500 л)

Этанолацетат

Клеточные остатки

Водная фаза

Экстракт в EtOAc

(1400 л, 5,2 мкг/мл γ1)

1.Концентрировали до сиропа

2. Выливали в 9 л гексана

Гексановый раствор

Осадок в гексане

1.Растворили в этилацетате

2. Высушили над Na2SO4

3. Осадили из эфира гексаном

Грубый калихимициновый комплекс

(53 г, 3,4г γ1, 2 г δ1 и следы других форм)

Хроматография на колонке С18 с

сепралитом

CH3CN-0,2 M NH4Oac (45:55)

Калихимицин α3

Калихимицин δ1 и γ1

Калихимицин γ1 и β1

6 г, 12% чистоты 9,8г, 22%δ1, 20% γ1 3,7 г, 60% γ1, 10%β1

Сефадекс LH20 Колонка с силикагелем Сефадекс LH20

Колонка (гексан-CH2Cl2-EtOH) (EtOH и MeOH (97:3)

2:1:1

Калихимицин α3

Калихимицин δ1

Калихимицин γ1

670 мг 1,472 мг 1508 мг

Калихимицин γ

Калихимицин β

1,818 мг (65% чистоты) 48 мг

Рис.4. Процесс получения иодинированных калихимицинов из среды

ферментации штамма UV785

существенно

повышена:

1)

многократной

обработкой

экстрагирующим агентом; 2) подбором оптимального растворителя; 3)

подогревом экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости,

содержащей продукт; 4) понижением давления в аппарате для экстракции,

что обеспечивает довольно эффективную экстракцию при относительно

низкой температуре. Последнее снижает затраты и уменьшает риск

инактивации извлекаемого продукта.

Почти полностью избежать инактивации позволяют методы

экстрагирования на холоду, т. е. путем использовании методов

криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым

субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое

находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция

проводится с применением растворителей, температура кипения которых

низка и при обычной комнатной температуре находящихся в газообразном

состоянии.

Криоэкстракция может применяться в сочетании с криоконсервацией

клеток. Клеточная биомасса может длительное время сохранять свои

свойства в условиях глубокого замораживания, а затем из нее может быть

экстрагирован целевой продукт.

В некоторых случаях экстрагирующий агент может быть не в

жидком, а в газообразном состоянии (при жидко-газофазной или твердо-

газофазной экстракции).

Адсорбция является достаточно распространенным методом

отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая

экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело.

Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или

газообразной

фазы

вещества

поверхностью

твердого

тела.

Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые

глины и т. п.

Более современные методы разделения веществ включают

хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку,

которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.

Разделение веществ путем хроматографии основано на их

неодинаковом распределении между двумя несмешивающимися фазами.

Различают хроматографию на бумаге, пластинках и колонках. При

хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся

фаз является движущийся растворитель, а другой (неподвижной фазой)

служат волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку какого-то

материала (например, силикагеля). При колоночной хроматографии

подвижной фазой является протекающий через колонку растворитель, а

неподвижную фазу представляет заполняющий колонку адсорбент (чаще

всего это гранулированный гель). Колоночная хроматография допускает

масштабирование процесса, в результате чего она довольно широко

применяется в промышленных условиях и включает несколько

разновидностей:

• Ионообменнаяхроматография, колонка наполняется гранулами

адсорбента, которые несут заряженные катионные (NH₄) или

анионные (SO₄) группы, способные захватывать ионы

противоположного заряда. Данный метод используется для

выделения ионизированных веществ из жидкости, а также для

очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы.

• Метод "молекулярныхсит", гель-хроматография, гель-фильтрация.

Виды хроматографии, основанные на разделении веществ с

различной молекулярной массой и диаметром частиц. Адсорбент

захватывает и удерживает, например, только низкомолекулярные

соединения, пропуская соединения с более высокой молекулярной

массой.

• Афиннаяхроматография. Метод базируется на задерживании

комплекса, образующегося из компонента разделяемой смеси и

лиганда, который фиксирован на частицах носителя (наполнителя

колонки). При данном методе используются агенты, способные

специфически связывать какое-нибудь одно конкретное вещество.

Например, фермент очищают на колонке, заполненной его

субстратом или специфическим ингибитором (таблица).

Весьма эффективный метод разделения и очистки белковых и

небелковых веществ основан на взаимодействии антигенов и антител.

Разработанный на основании таких взаимодействий способ получил

название имунно-аффинной хроматографии, который существенно

повысил разрешающую способность при введении в практику

использования моноклональных антител. Блестящей иллюстрацией его

эффективности является высокая степень одноэтапной очистки

человеческого интерферона (чистота повышается примерно в 500 раз).

В аффинной хроматографии могут использоваться групповые

лиганды, связывающие, например, группу сходных по структуре

ферментов. Такими лигандами являются кофакторы ферментов или их

аналоги. Могут применяться и еще менее специфичные лиганды,

связывающие довольно обширные классы веществ; например, алкильные

и арильные группы или лиганды, представляющие собой текстильные

красители.

Преимущество аффинной хроматографии состоит в том, что с ее

помощью можно в одну стадию осуществить полную очистку продукта из

сложной многокомпонентной смеси (культуральной жидкости, цельных

клеточных экстрактов и т. п.), тогда как другие способы требуют

многоэтапной очистки и сопряжены с большими затратами труда и

времени. Однако метод имеет и ряд недостатков, в частности высокая

цена материалов, используемых в аффинной хроматографии (например,

веществ, применяемых в качестве лигандов), а также быстрое забивание

колонки пропускаемыми веществами. Последнее заставляет использовать

их в периодическом, а не в непрерывном режиме. После каждого

выделения продукта колонки промывают и частицы заполняющего геля

также подвергаются очистке.

Помимо аффинной хроматографии (которая иногда называется еще

аффинной адсорбцией в геле) в крупномасштабных биотехнологических

процессах для очистки продуктов все шире применяют аффинную

преципитацию и аффинное разделение.

При аффинной преципитации лиганд соединяется с растворимым

носителем и, после взаимодействия с соответствующим выделяемым

соединением, образующийся комплекс по мере его формирования

выпадает в осадок. Иногда ускорение выпадения преципитата достигается

путем добавления электролитов.

Аффинное разделение основано на использовании системы,

состоящей из двух водорастворимых полимеров, один из которых несет

специфические лиганды, а другой обладает сродством к примесным

компонентам. В качестве примера можно привести разделение

нуклеиновых кислот и белков. Для полимера, соединяемого с лигандом,

берется полиэтиленгликоль, а другим компонентом является декстран.

Наряду с хроматографией перспективными методами разделения

веществ при биотехнологических процессах являются электрофорез и его

модификации. В этих методах разделяемая смесь помещается в мощное

электрическое поле, обеспечивающее движение ионизированных

компонентов смеси. Различие в электрофоретической подвижности

позволяет пространственно разделить входящие в ее состав компоненты.

Современные варианты электрофореза используют (как и хроматография)

пластинки или колонки с образующими гель наполнителями (агароза,

полиакриламид, сефароза, оксиапатит и др.).

Модификацией метода электрофореза является изоэлектрическая

фокусировка или электрофокусировка. В этом методе раствор,

насыщающий гель, содержит соединение с кислотно-основными

группами. Под влиянием электрического поля кислотно-основные группы

буферного соединения меняют степень ионизации, создавая тем самым

градиент рН в направлении электрического поля. Электрически

заряженные компоненты разделяемой смеси, нанесенной на гель,

мигрируют по направлению к электроду противоположного знака.

Поскольку эти компоненты передвигаются по градиенту рН, то они

постепенно теряют свои заряды и в зоне, где рН соответствует

изоэлектрической точке (точке электронейтральности), их движение

прекращается. Каждый компонент концентрируется (фокусируется) в

определенной области геля.