2015-05-12
365
I. Бактериальная амилаза
* Определение кинетических параметров, Km и Vmax, реакции гидролиза крахмала под действием бактериальной амилазы
1. В 5 пробирок вносят по 1 мл препарата амилазы слюны. Затем в каждую добавляют по 1 мл воды.
2. Пробирки инкубируют в термостате при 38°С в течение 1 мин.
3. Последовательно, точно отметив начальное время реакции, в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала в концентрации, указанной в таблице:
| № пробирки | |||||
| Концентрация крахмала, мМ | 0,5 | 0,25 | 0,125 |
4. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I2 в KI (реактива Люголя). Пробы инкубируют в течение 10 мин.
5. Определяют оптическую плотность при l=620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:
| № пробирки | Концентрация крахмала, мМ | А620 |
| 0,5 | ||
| 0,25 | ||
| 0,125 |
6. Строят график зависимости V отн от [S]. По графику Лайнуивера-Бэрка определяют значение К m
* Влияние активаторов и ингибиторов на кинетические параметры бактериальной амилазы
|
|
|
1. В 10 пробирок вносят по 1 мл раствора фермента.
2. В первые 5 пробирок (серия № 1) добавляют по 1 мл 1 % раствора NaCl, в оставшиеся (серия № 2) - по 1 мл 2 % раствора CuSO4.
3. Пробирки инкубируют в термостате при 38°С в течение 1 мин.
4. Добавление 1 мл субстрата в указанной в таблице концентрации (см. предыдущее задание) проводят попарно в каждую серию пробирок, например, через 2 мин.
5. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I2 в KI. Пробы инкубируют в течение 10 мин.
6. Проводят фотометрирование образцов при l=620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:
| № пробирки | А620 | |
| Серия №1 (без ингибитора) | Серия №2 (с ингибитором) | |
7. Строят график зависимости V отн от [S] для первой (с NaCl) и второй (с СuSO4) серий проб. Рассчитывают K m и V max для скорости реакции расщепления крахмала в отсутствии и присутствии ингибитора, пользуясь графиком Лайнуивера-Берка.
