Современные представления и знания о механизмах активации чекпойнтов и белках, вовлеченных в разные стадии этого процесса

Повреждения, индуцированные в ДНК действием ионизирующей радиации, влияют на пути активации точек сверки (чекпойнтов), которые останавливают движение клетки в G1 и G2 фазах, и вызывает временную задержку в прохождении фазы S. Чекпойнты совместно с репарацией и апоптозом вовлечены в круговорот, который определяет основной ответ клетки на повреждение ДНК. Активация чекпойнт-ответа обычно включает сенсоры и медиаторы повреждений ДНК, переносчики сигнала и эффекторы. Вероятно, главную роль в чекпойнт-ответе играют белки ATR и ATM, а также CHK1 и CHK2-киназы. Также важна роль лежащих ниже эффекторов, таких как P53 и семейство белков-фосфатаз CDC25. Процессы репарации ДНК и геномной стабильности напрямую связаны с активацией чекпойнтов.

Уже не менее 50 лет известно, что облучение вызывает задержку нормального прохождения клеток по циклу. Причем остановки происходят во всех фазах, хотя в G2 их легче всего обнаружить. Раньше эту задержку рассматривали как пассивный ответ клетки, причиной которого были повреждения в ДНК. Было очевидно, что в клетке инициируются особые процессы, помогающие облученным клеткам каким-то образом бороться с возникшими повреждениями и облегчить их репарацию. В 1980 году Пэйтнер с соавторами показали, что подобная задержка или крайне мала или полностью отсутствует в клетках больных АТ, которые в тоже время являются крайне чувствительными к ионизирующей радиации. Затем были выделены дрожжевые мутанты с повышенной чувствительностью к радиации и отсутствием задержки клеточного цикла. К настоящему времени стало понятно, что существуют механизмы «обзора» генома (genome-surveillance), обычно определяемые термином «чекпойнт повреждений ДНК» (DNA damage chekpoint), лишь одним из проявлений которого является задержка клеточного цикла. Современные научные представления допускают, что единство задержек, вызванных облучением на разных стадиях клеточного цикла, оказывается зависимым от активации отдельного чекпойнта повреждений ДНК.

Параллельно изучались и последовательно выстраивались и сами процессы, необходимые для прохождения клеткой всех фаз клеточного цикла. К настоящему времени подтверждено, что клеточный цикл контролируется независимыми регуляторными переходами, которые приводят ДНК в состояние, способное к удвоению и клеточному делению. Эти переходы завершаются активацией циклин-зависимых киназ (CDKs), действием протеолитических путей и изменением состояния хроматина. CDKs являются основными компонентами белковой машины клеточного цикла и их активность строго регулируется несколькими независимыми путями, включая ассоциацию с соответствующими циклинами, фосфорелирование по определенным серин/треониновым или тирозиновым аминокислотным остаткам и связывание со специфическими белками-ингибиторами. Не удивительно, что CDKs являются также и одними из основных мишеней чекпойнт-ответа. Продвижение по клеточному циклу, опосредованное соответствующей белковой машиной, «проверяется» механизмами «обзора», который следит за тем, чтобы клетки не перешли в следующую фазу, пока все обытия предыдущей фазы не завершены. Эти механизмы «обзора», известные как чекпойнты клеточного цикла, являются идеологически (концептуально) отличными от чекпойнтов ДНК повреждений. Хотя наше современное знание о молекулярных механизмах различных чекпойнтов выявляет все большее их сходство.

Подобно многим другим областям современной биологии, изучение чекпойнтов питается убеждением, что уточнение их молекулярных механизмов будет способствовать пониманию причин геномной нестабильности и рака, так как любой ген, вовлеченный в чекпойнты ДНК повреждений, важен для стабильности генома и\или связан с наследственной предрасположенностью к раку. К тому же нарушение чекпойнт-контроля может быть отличительным признаком опухолевых клеток, поэтому большие усилия прикладываются для поиска агентов, которые могли бы сломать эти нарушенные чекпойнты. Подобные агенты можно было бы использовать в противоопухолевой терапии совместно с другими, например с облучением.

15.1. Генеральные концепции и основные игроки.

Чекпойнты повреждений ДНК определяются как система взаимодействующих путей, работающих совместно, распознавая повреждения в ДНК и вызывая клеточный ответ. Процесс передачи сигнала и участвующие в нем белки формально разделяются на сенсоры, переносчики и эффекторы, как показано в табл. 7. Сенсоры прямо или опосредованно распознают повреждения ДНК, служат сигналом этих нарушений и инициируют каскад биохимических реакций. Переносчиками обычно являются протеинкиназы, которые изменяют и усиливают сигнал о повреждениях от сенсоров, фосфорелируя другие киназы или нижележащие белки- мишени. Эффекторные белки включают самые последние нижележащие мишени протенкиназ - переносчиков сигнала. Эффекторный уровень чекпойнта повреждений ДНК пересекается с машиной клеточного цикла. В таблице приведены белки, которые сейчас считаются основными сенсорами и переносчиками. Впервые мы употребляли эти термины, описывая процессы репарации двунитевых разрывов ДНК.

До сих пор остается неясным самый первый шаг в распознавании ДНК-повреждений. Первоначально кандидатами на роль первичных сенсоров были признаны два белка, способные непосредственно активироваться при связывании с одно- и двунитевыми разрывами ДНК. Это, соответственно, полимераза поли(АДФ)-рибозы PARP и ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK. Однако вскоре стало ясно, что эти белки не яляются необходимыми для инициации глобального ответа клетки на повреждения, и имеют только локальное значение, хотя DNA-PK, вероятно, каким-то образом способствует восстановлению S-фазы после задержки.

В работах на бактериях, а затем на эукариотических клетках было показано, что однонитевая ДНК способна инициировать сигнал для некоторых путей репарации. Но это не стыкуется с представлением о том, что чекпойнт-сигналы связаны с двунитевыми разрывами ДНК, то есть инициируются двунитевой ДНК и/или связанными с ней изменениями конформации хроматина. Если это так, то те пути репарации, при которых образуются протяженные участки двунитевой ДНК должны генерировать более сильный чекпойнт-ответ, чем те, при которых количество двунитевый ДНК ограничено. То есть, негомологическое воссоединение концов будет давать более слабый сигнал, чем гомологическая рекомбинация, при которой в процесс репарации вовлечены более протяженные участки двунитевой ДНК.

Таблица 7. Белки чекпойнт-ответа клетки на повреждение ДНК.

В настоящее время работы на дрожжевых моделях выявили два белковых комплекса – кандидата на роль сенсоров: Rad17-RFC и 9-1-1, о которых мы говорили, изучая остановку репликации при повреждении ДНК. У этих комплексов есть функциональные гомологи в системе репликации ДНК и их функции частично подобны таковым при чекпойнт-ответе. Rad17-RFC комплекс состоит из Rad17и четырех небольших субъединиц репликативного комплекса RFC (RFC2, RFC3, RFC4, RFC5), состоящего из 5 субъединиц. RFC распознает и связывается с узлом однонитевой /двунитевой ДНК и способствует «загрузке» на ДНК гомотримерного белка, обладающего «зажим»-подобной структурой, необходимого для усиления процессивности ДНК-полимераз δ и ε. Это подтверждает точку зрения, что Rad17-RFC комплекс служит «загрузчиком» комплекса 9-1-1 на поврежденную ДНК. 9-1-1 комплекс состоит из субъединиц RAD9, HUS1 и RAD1, которые взаимодействуют между собой и образуют PCNA-подобную структуру, которая «загружается» на ДНК как скользящий зажим, так же как и PCNA. Есть предположение, что 9-1-1 комплекс также увеличивает количество вовлеченной в реакцию двунитевой ДНК для того, чтобы усилить чекпойнт-ответ. К сожалению, до сих пор остается неясным, как именно RAD17-RFC и 9-1-1 комплексы вовлечены в процесс инициации сигнала на двунитевых разрывах и вообще функционируют во время хорошо известных путей репарации двунивых разрывов ДНК.

Другие белки, такие как комплекс Mre11-RAD50-NBS1 и BRCA1 участвуют в распознавании именно двунитевых разрывов ДНК. BRCA1, вероятно, является адаптором, предоставляющим дополнительные мишени для фосфорелирования киназам-переносчикам сигнала, он взаимодействует с большим числом белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, и собирает белковый комплекс, вероятно, участвующий в инициации и передаче сигнала (BASC - BRCA1 associated genom surveillance complex). Каковы основные функции BRCA1 – сенсорные или трансдусерные – до сих пор неясно.

Белки, называемые медиаторами, прототипом которых является дрожжевой RAD9, участвуют в передаче сигнала. Они содержат два повторяющихся домена, обнаруженных в С-конце белка BRCA1 и названных поэтому BRCТ-доменами. BRCТ-содержащие белки найдены у млекопитающих, но имеют функции, сходные с таковыми дрожжевого RAD9. Среди подобных белков описаны BRCA1, TopBP1 (topoisomerase II binding protein I), 53BP1 (P53 binding protein I) и MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein I). Все эти белки вовлечены в чекпойнт-ответ, они распознают повреждения ДНК и привлекают другие белки, которые облегчают передачу сигнала вниз и репарацию ДНК.

Две активно изучаемые киназы из семейсва PI3-киназ (фосфоинозитол-3-киназы) ATM и ATR работают непосредственно сразу же после сенсоров повреждений. АТМ играет решающую роль в чекпойнтах повреждений ДНК, контролируя начальное фосфорилирование многих ключевых белков общего ответа, например таких, как Р53, MDM2, BRCA1, CHK2, MDC1 и NSB1. При отсутствии АТМ ее функции частично берет на себя ATR, сходная с ней по структуре и хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе, а клетки в культуре нежизнеспособны. Ассоциированный с ATR человеческий синдром (синдром Секеля) выявлен всего два года назад.

Не ясно до конца, каким именно образом ATR и ATM активируются сами (взаимное фосфорилирование АТМ в гомодимере) в ответ на различные воздействия, и как они помогают другим белкам связываться с ДНК (по принципу Ku и DNA-PK). Недавно показано, что ATR образует гетеродимер со специфическим белком ATRIP (ATR interacting protein I), что важно для чекпойнт-сигнала, хотя механизм этой важности остается неизвестным. Может быть подобный партнер существует и у АТМ.

Современные данные утверждают, что именно АТМ определяет ранний чекпойнт-ответ, а ATR действует позднее, когда уже идет репарация ДНК повреждений, как вызванных радиацией, так и ультрафиолетом или остановкой репликативных вилок.

Следующим шагом в генерации чекпойнт-ответа является активация СНК1 и СНК2 киназ (checkpint kinase 1 and 2). Эти структурно неродственные киназы имеют частично перекрывающуюся специфичность, то есть часто фосфорилируют одни и те же белки. СНК2 фосфорилируется АТМ, что приводит к ее активации. СНК1 фосфорилируется по серину-345 ATR в ответ на действие ультрафиолета или гидроксимочевины. Таким образом в процессе формирования чекпойт-ответа АТМ функционально связана с СНК2, а ATR - с СНК1.