Методы обнаружения вирусов

Рис. 2. Внутриклеточные включения при вирусных заболеваниях

Метод культивирования вирусов в клетках культуры ткани является самым распространенным. Благодаря ему стало возможным изучение синтеза отдельных компонентов вируса, влияния репродукции вируса на метаболические процессы самой клетки.

Источником получения клеток служат ткани и органы эмбрионов, забитых птиц и животных, а также ткани, извлеченные у человека при хирургических операциях. Используются нормальные и злокачественно перерожденные клетки: эпителиальные, фибробластические и смешанные. Способность извлеченных из организма клеток размножению вне организма тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше ткань дифференцирована, тем большей способностью к пролиферации обладают ее клетки. Поэтому клетки опухолевых и эмбриональных тканей легче культивируются вне организма, чем нормальные клетки взрослого организма.

Для роста и размножения клеток вне организма необходимо определенное содержание органических соединений, аминокислот, белков, витаминов, кислорода, углекислоты. Оптимальный рост и развитие клеток обеспечивается при рН 7,2–7,4.

Для приготовления и выращивания культур клеток употребляются:

1) Растворы: Хенкса – содержит хлористые соли натрия, калия, кальция, магния; Берсена – содержит натриевую соль этилендиаминотетрауксусной кислоты, применяется для снятия клеток с поверхности стекла.

2) Питательные среды: а) синтетические или полусинтетические

- поддерживающие клетки в жизнеспособном состоянии – среда 199, среда Игла

- обеспечивающие рост и размножение клеток – среда 199 с добавлением гидролизата лактальбумина

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов. Для получения первично трипсинизированной культуры ткани используют эмбрионы человека (10–12 недельные), кур, почки обезьян, кроликов и др. Ткань измельчают ножницами в среде 199, многократно промывают раствором Хенкса, после чего заливают 0,25% раствором трипсина для разъединения клеток. Полученную однородную суспензию изолированных клеток дважды отмывают от трипсина раствором Хенкса, центрифугируют, осадок разводят средой 199 так, чтобы получить взвесь, содержащую в 1 мл 10000–40000 клеток. К взвеси клеток добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл, разливают по пробиркам и помещают в термостат на 4-5 дней.

Цитопатогенное действие вируса. Вирус, внесенный в тканевые культуры, проникает в клетки и репродуцирует. Клетки при этом повреждаются, это сопровождается морфологическими изменениями, часть клеток погибает. Изменения в ткани, вызванные вирусами, называют цитопатогенным действием вируса. Вирусы вызывают цитопатогенное действие трех типов:

· образование симпластов

· круглоклеточную дегенерацию

· очаги клеточной пролиферации

Некоторые вирусы можно обнаружить в пораженных клетках по наличию включений в ядре или цитоплазме. Включения представляют собой скопления вирионов или реакцию клетки на присутствие в ней вирусов.

Титрование вируса в культуре производят методом подсчета бляшек. Вирус размножается в зараженных клетках, они дегенерируют и не воспринимают прижизненную окраску нейтральным красным. Причем размножению одной вирусной частицы соответствует одна бляшка. На розовом фоне видны неокрашенные бляшки диаметром 1–3 мм.

Реакция гемадсорбции. Некоторые вирусы не вызывают изменений культуры клеток и не дают отчетливый цитопатогенный эффект. В этом случае присутствие вирусов можно обнаружить в реакции гемадсорбции. Сущность реакции заключается в том, что на поверхности клеток, зараженных вирусом, адсорбируются эритроциты. Скопление эритроцитов на клеточном слое можно наблюдать под микроскопом.

Схема 7