Методика анализа

Изолирование. 25 г мелкоизмельченных органов (средняя проба из 100г) заливают в стакане емкостью 200мл 0,5 н раствором соляной кислоты (рН 1) и оставляют при комнатной температуре в течение час, периодически перемешивая и проверяя значение рН среды. Настаивание повторяют 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяют, процеживают через тонкий тампон в делительную воронку на 250 мл и устанавливают рН 3 по универсальному индикатору. Экстрагируют хлороформом трижды по 15 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием извлечения в течение 10 минут при 5000 об/мин. Органическую фазу переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия, доводят хлороформом до метки и перемешивают. Извлечение исследуют на содержание вещества и его метаболитов.

Хроматографическое исследование. На стартовую линию хроматографической пластинки наносят остаток 1/5 части извлечения, растворенный в минимальном количестве хлороформа. На расстоянии 2 см от первой точки наносят в виде полос 1 см этанольные растворы (1мг/мл) препарата и его метаболитов. Хроматографируют в системе насыщенной парами этилацетат - абсолютный этиловый спирт 9:1. Пробег растворителей 10 см. По удалении растворителей пластинку обрабатывают концентрированной соляной кислотой до полного увлажнения слоя силикагеля. Накрывают покровным стеклом, избегая, прилипания влажного слоя силикагеля и термостатируют при 135-140 °С. По истечении 20 минут покровной стекло снимают, а хроматограмму оставляют в термостате еще на 5 минут. После охлаждения пластинки слой сорбента обрабатывают последовательно реагентами для образования азокрасителя.

Одновременно с первой пластинкой в эту же хроматографическую камеру помещают вторую, на стартовую линию которой наносят полосой 1,5 см остатки из 2/5 и 1/5 части экстрактов. В третью полосу, длиной 1 см, наносят метчик, смесь стандартных растворов (1мг/мл). После поднятия растворителя на 10 см и удаления его со слоя сорбента в токе воздуха, для дополнительной очистки эту пластинку хроматографируют в метаноле с предварительным насыщением камеры в течение 15 минут. После поднятия растворителя на 10 см и удаления его со слоя сорбента в токе воздуха зону, соответствующею 2/5 экстракта, прикрывают стеклом. Остальную часть хроматографической пластинки обрабатывают последовательно реактивом Драгендорфа (модифицированным) и 10 % раствором серной кислоты.. При наличии препаратов 1,4бенздиазепина наблюдаются оранжево-красного цвета пятна. Слой сорбента из зоны соответствующею 2/5 экстракта, параллельно пятнам снимают, и элюируют ацетоном дважды по 5 мл в мерную пробирку.