Определение ферментативной активности ферментных препаратов

Определение осахаривающей активности йодометрическим методом

Осахаривающая активность характеризует способность солода или ФП микробного происхождения гидролизовать крахмал до редуцирующих сахаров: мальтозы, глюкозы или их смеси. Мальтоза является конечным продуктом гидролиза крахмала растительными a- и b-амилазами. Таким образом, осахаривающая активность отражает действие одного или нескольких ферментов на данный субстрат. Осахаривающую активность ОАК (в литературе чаще принято называть ее ОС) выражают числом единиц, содержащихся в 1 г, 1 см³ осахаривающего материала.

Осахаривающую активность определяют тремя методами: йодометрическим, колориметрическим с использованием антрона и поляриметрическим.

Осахаривающая активность определяется в условиях гидролиза растворимого крахмала в пределах 25% гликозидных связей, что соответствует гидролизу примерно 50% крахмала до мальтозы или мальтозы в смеси с глюкозой. За единицу ОАК принимают такое количество фермента, которое в строго определенных условиях за 1 мин при температуре 30⁰С катализирует расщепление до восстанавливающих сахаров 1 микроэквивалент гликозидных связей.

Определение осахаривающей активности амилосубтилина Г10х

Анализу подвергают препарат, полученный при выращивании продуцента глубинным способом.

Реактивы и аппаратура: 0,1 моль/дм³ раствор йода (25 г КJ ч.д.а. растворяют в 2 – 3 см³ воды и добавляют 12,5 г х.ч. йода. После растворения йода объем раствора доводят до 1 дм³ дистиллированной водой. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой. Титр устанавливают по 0,1моль/дм³ раствору тиосульфата натрия. Концентрация раствора йода должна быть в пределах 0,95 – 1,05 моль/дм³); 0,1 моль/дм³ раствор тиосульфата натрия (25 г тиосульфата ч.д.а. растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, не содержащей СО₂); 1 моль/дм³ раствор НС1; 0,1моль/дм³ раствор гидроксида натрия; раствор серной кислоты 1: 4 (к четырем объемам дистиллированной воды приливают один объем кислоты); фосфатный буферный раствор с рН 6,0 готовят смешиванием 9 объемов раствора I (9,077 г КН₂РО₄ растворяют в 1 дм³ воды) и одного раствора 2 (23,883 г К₂НРО₄ × 2Н₂О растворяют в 1 дм³ воды); 1%-й раствор крахмала.

Ход определения. Вначале готовят 1%-й раствор крахмала, как при определении амилолитической активности солода, но вместо фосфатного буфера с рН 4,7 – 4,9 используют 10 см³ фосфатного буферного раствора с рН6,0.

Для приготовления раствора ФП взвешивают 0,1 г препарата в сухом стакане вместимостью 25–30 см³. Навеску осторожно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды. Полученную смесь быстро и без потерь переносят дистиллированной водой в колбу на 100 см³. После доведения до метки смесь перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. Раствор хранят не более 24 ч при температуре от +2 до –4⁰С. Далее осахаривают крахмал и определяют сахар йодометрически. Схема рабочего и контрольного опытов, которые проводят одновременно, приведена ниже.

Расхождение между результатами титрования контрольного Б и опытного А растворов должно составлять 0,5 – 6 см³ 0,1 моль/дм³ раствора тиосульфата натрия. Если расхождение меньше 0,5 или больше 6 см³, анализ повторяют с большим или меньшим количеством ферментного раствора.

Осахаривающую активность ОАК (в ед/г) рассчитывают по формуле

ОАК = е₁: (m ×τ),

где е₁ – количество единиц активности в микроэквивалентах гликозидных связей, найденных по табл. 4, в соответствии с результатами титрования;

m – количество ФП, введенного в реакционную смесь, г;

τ – время гидролиза, мин.

Пример. Определить осахаривающую активность амилосубтилина Г10х, если на анализ израсходовано 0,1 г исходного ФП.

На титрование контрольного раствора пошло 19,6 см³ (Б), а рабочего – 17,6 см³ (А) 0,1 моль/дм³ раствора Na₂S₂O₃, следовательно, Б – А = 19,6 – 17,6 = 2 см³. По таблице 4 величине 2 см³ соответствует число единиц активности е₁ = 113,1. Время гидролиза – 10 мин; m = (0,1: 100) × 1 = 0,001 г. Тогда ОАК = 113,1: (0,001 × 10) = = 11310 ед/г.

	Рабочий опыт (А)		Контрольный опыт (Б)
	1%-й раствор крахмала (20 см3)		1%-й раствор крахмала (20 см3)
	Инкубирование субстрата в конической колбе на 50 см3 (t = 30 ± 0,20С, τ = 10 мин)	1 моль/дм3 р-р НС1 2 см3	Смешивание субстрата с соляной кислотой
	20 см3		22 см3
Р-р ФП 1-10 см3 Вода 9-0 см3	Ферментативный гидролиз крахмала до сахаров (t = 30 ± 0,20С, τ = 10 мин)	Р-р ФП 1-10 см3 Вода 9-0 см3	Смешивание подкисленного субстрата с р-ром ферментов (инактивация ферментов)
	30 см3		32 см3
1 моль/дм3 р-р НС1 2 см3	Кислотная инактивация ферментов
	32 см3
0,1 моль/дм3 р-р J2 20 см3 0,1 моль/дм3 р-р NаОН 52,5 см3	Йодометрическое окисление сахаров прогидролизованного субстрата в щелочной среде (t = 20 0С, τ = 15 мин; колба коническая на 300-400 см3, закрытая часовым стеклом)	0,1 моль/дм3 р-р J2 20 см3 0,1 моль/дм3 р-р NаОН 52,5 см3	Йодометрическое окисление сахаров исходного субстрата и ФП (t = 20 0С, τ = 15 мин; колба коническая на 300-400 см3, закрытая часовым стеклом)
	104,5 см3		104,5 см3
Р-р Н2SО4: Н2О = 1: 4 2 см3	Нейтрализация и подкисление среды	Р-р Н2SО4:Н2О=1:4 2 см3	Нейтрализация и подкисление среды
	106,5 см3		106,5 см3
0,1 моль/дм3р-р Na2S2O3	Определение избытка йода в рабочем опыте	0,1 моль/дм3р-р Na2S2O3	Определение избытка йода в рабочем опыте

Расчет величины А Расчет величины Б

Рисунок 1 – Схема определения осахаривающей активности ферментного препарата

Таблица 4 – Количество микроэквивалентов гликозидных связей (е₁) в зависимости от расхода 0,1 моль/дм³ раствора Na₂S₂O₃

Количество 0,1 моль/дм3 раствора Na2S2O3, см3	Количество микроэквивалентов гликозидных связей, е1	Количество 0,1 моль/дм3 раствора Na2S2O3, см3	Количество микроэквивалентов гликозидных связей, е1
0,9	45,0	2,6	169,7
1,0	52,1	2,7	180,9
1,1	58,7	2,8	192,3
1,2	63,3	2,9	209,9
1,3	67,8	3,0	226,1
1,4	74,7	3,1	250,6
1,4	81,4	3,2	278,2
1,6	85,9	3,3	312,1
1,7	92,7	3,4	366,2
1,8	99,6	3,5	452,3
1,9	108,5	3,6	517,9
2,0	113,1	3,7	585,7
2,1	119,9	3,8	662,7
2,2	128,8	3,9	740,3
2,3	138,0	4,0	811,9
2,4	150,3	4,1	891,6
2,5	158,3	4,2	968,1

Определение протеолитической способности методом Лейлян‑Фольгарда

Протеолитическая способность (ПС) характеризует способность протеолитических ферментов расщеплять белок (казеин). За единицу протеолитической способности принято такое количество фермента, которое за 1 час при температуре 30⁰С расщепляет 1 г казеина. Протеолитическую способность выражают числом указанных единиц в 1 г сухого препарата. При таком способе выражения ПС непосредственно показывает, сколько граммов казеина может быть прогидролизовано 1 г культуры при температуре 30⁰С за 1 ч (в условиях, соответствующих условиям определения).

Для определения ПС растворенный при помощи гидроксида натрия казеин подвергают действию исследуемого ферментного препарата. После ферментативного воздействия в течение часа в опыте и перед добавлением такого же количества ферментного раствора в контроле ферментативную активность прерывают титрованным раствором соляной кислоты. Казеин, оставшийся нерасщепленным, количественно осаждают сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увлекает в связанном состоянии соответствующее количество соляной кислоты. Осадки отфильтровывют, а фильтраты титруют 0,1 моль/дм³ раствором NаОН. Разность между расходом 0,1 моль/дм³ раствора NаОН на титрование в опыте и в контроле принимают за меру протеолитической активности исследуемой культуры.

Реактивы: 5%-й щелочной раствор казеина – 50 г (по сухому веществу) технически измельченного казеина помещают в химический стакан емкостью 1 дм³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды и оставляют на 30 мин. Затем помещают стакан в водяную баню температурой 65–70⁰С. Постепенно при тщательном перемешивании стеклянной палочкой прибавляют 50 см³ 1 моль/дм³ раствора NаОН. В процессе растворения казеина прибавляют небольшими порциями воду (5–6 раз по 50–80 см³), нагретую до температуры 65–70⁰С, и выдерживают на водяной бане до полного исчезновения комочков. После полного растворения казеина и охлаждения раствор переливают в мерную колбу на 1 дм³, доводят объем до метки водой, перемешивают и фильтруют через четыре слоя марли; 0,1 моль/дм³ раствор НС1 в 7,5%-ом растворе сульфата натрия - Na₂SO₄; 1 моль/дм³ раствор NаОН; 0,1 моль/дм³ раствор NаОН; раствор крезолового красного – 0,5 г крезолового красного растворяют в 100 см³ 96%-го ректификованного спирта и фильтруют.

Ход определения. Ферментный раствор приготавливают так: на технических весах взвешивают 1,00 г тщательно измельченной культуры, переводят в колбу на 200–300 см³, приливают 50 или 100 см³ дистиллированной воды и настаивают в течение часа при комнатной температуре, периодически перемешивая через каждые 10 мин, затем фильтруют через складчатый фильтр.

В колбы емкостью около 100 см³ (два параллельных определения) набирают пипеткой по 20 см³ раствора казеина и помещают в водяную баню температурой 30±0,2⁰С. Через 10 мин в колбы вводят при помешивании 10 см³ ферментного раствора. Общий объем раствора казеина и ферментного раствора должен быть равен 30 см³; если для определения берут меньше 10 см³ ферментного раствора, недостающий до 30 см³ объем восполняют дистиллированной водой, которую вводят непосредственно перед введением ферментного раствора.

Ровно через час в колбы добавляют при перемешивании 20 см³ 0,1 моль/дм³ раствор НС1 в 7,5%-ом растворе Na₂SO₄ и немедленно фильтруют до полной прозрачности, возвращая фильтрат на фильтр.

Контрольные пробы (также два параллельных определения) ставят таким же образом, только до введения ферментного раствора прибавляют раствор НС1 в 7,5%-ом растворе Na₂SO₄ и не выдерживают колбы на водяной бане, а сразу фильтруют.

В 20 см³ фильтрата контрольных и опытных определений оттитровывают избыток соляной кислоты 0,1 моль/дм³ раствором NaOH в присутствии двух капель крезолового красного до красного окрашивания. Разность в расходе на титрование опытных и контрольных проб 0,1 моль/дм³ раствора NaOH, отнесенная к 10 см³ фильтрата, может составить 0,4–2,5 см³. Если она менее 0,4 или более 2,5 см³, определение повторяют с большей или меньшей дозировкой фермента, изменяя количество вводимого ферментного раствора или его разведение. По разности расхода щелочи на титрование опытной и контрольной проб, пользуясь таблицей 5, находят протеолитическую способность культуры при условии, что для определения взято 10 см³ ферментного раствора в разведении 1: 100. При других дозировках культуры величину ПС рассчитывают по формуле

ПС = е / n,

где е – число единиц, найденное по таблице (по результатам титрования);

n – количество культуры, соответствующее 10 см³ фильтрата (1/5 от количества,

прибавленного в колбу), г или см³.

Пересчет активности на сухое вещество ведут по формуле

,

где W – влажность культуры, %.

Пример. Для определения взято 10 см³ ферментного раствора в разведении 1: 100. На титрование опытной пробы израсходовано 4,8 см³ 0,1моль/дм³ раствора NaOH; на титрование контрольной пробы – 2,0 см³. Разность в пересчете на 10 см³ фильтрата (4,8 – 2,0): 2 = 1,4 см³ 0,1 моль/дм³ раствора NaOH. По таблице величина 1,4 соответствует ПС = 4,950.

Влажность культуры 12%.

ед.

Таблица 5 – Пересчет (см³) 0,1 моль/дм³ раствора NaOH в протеолитическую способность на воздушно-сухое вещество

Разность между расх. 0,1 моль/дм3 р-ра NaOH в опыте и контроле, см3 / 10 см3 фильтрата	Едини-цы протео-лити-ческой актив-ности	ПС при введении 10 см3 раствора в разведении	Разность между расх. 0,1 моль/дм3 р-ра NaOH в опыте и контроле, см3 / 10 см3 фильтрата	Едини-цы протео-лити-ческой актив-ности	ПС при введении 10 см3 раствора в разведении
1: 100	1:50	1:100	1:50
0,30	0,0123	0,615	0,308	1,45	0,1033	5,165	2,582
0,35	0,0167	0,835	0,418	1,50	0,1080	5,400	2,700
0,40	0,0203	1,015	0,508	1,55	0,1123	5,616	2,808
0,45	0,0243	1,215	0,608	1,60	0,1167	5,835	2,918
0,50	0,0283	1,415	0,708	1,65	0,1213	6,065	3,032
0,55	0,0320	1,600	0,800	1,70	0,1260	6,300	3,150
0,60	0,0360	1,800	0,900	1,75	0,1307	6,535	3,268
0,65	0,0393	1,965	0,982	1,80	0,1353	6,765	3,382
0,70	0,0433	2,165	1,082	1,85	0,1400	7,000	3,500
0,75	0,0473	2,365	1,182	1,90	0,1453	7,265	3,632
0,80	0,0513	2,565	1,282	1,95	0,1500	7,500	3,750
0,85	0, 0550	2,750	1,375	2,00	0,1556	7,780	3,890
0,90	0,0590	2,950	1,475	2,05	0,1603	8,015	4,008
0,95	0,0627	3,135	1,568	2,10	0,1653	8,265	4,132
1,00	0,0667	3,335	1,668	2,15	0,1707	8,535	4,268
1,05	0,0700	3,500	1,750	2,20	0,1760	8,800	4,400
1,10	0,0747	3,735	1,868	2,25	0,1817	9,085	4,542
1,15	0,0787	3,935	1,968	2,30	0,1873	9,365	4,682
1,20	0,0827	4,135	2,068	2,35	0,1933	9,665	4,832
1,25	0,0867	4,335	2,168	2,40	0,1993	9,965	4,982
1,30	0,0907	4,535	2,268	2,45	0,2053	10,265	5,182
1,35	0,0950	4,750	2,375	2,50	0,2113	10,565	5,282
1,40	0,0990	4,950	2,475