Метод агаровых сеток

Метод «агаровой сетки» был разработан» с целью оптимизации и стандартизации условий роста микроскопических мицелиальных грибов на поверхности бетона, древесины,бумаги, лакокрасочных покрытий, других природных и синтетических материалов с фунгицидными добавками. Сущность метода заключается в том, что на поверхность испытуемых образцов, помещенных в чашки Петри, наносят небольшое количество стандартной агаризованной питательной среды (среда Чапека, Чапека-Докса и др.), которая при застывании была тщательно перемешана и смешана со спорами тест-культуры гриба.

Инокулированную среду равномерно распределяют по поверхности образца в присутствии сетчатого шаблона. После снятия шаблона на образце остается так называемая «агаровая сетка», представляющая собой разделенный на миниатюрные блоки сетью борозд слой агаризованной среды, высота которого равна толщине сетчатого шаблона. Чтобы избежать высыхания среды образцы помещают на увлажненные бумажные фильтры или слой агарового геля («голодный агар»). Чашки

Петри инкубируют в термостате с оптимальной для роста гриба температурой.

Через определенные промежутки времени, не реже чем 1 раз в сутки, несколько ячеек агаровой сетки снимают с образцов, помещают на предметные стекла в каплю воды и микроскопируют в проходящем свете.

В качестве критерия фунгитоксичности может выступать длительность лаг-фазы (время от нанесения агаровой сетки до начала массового прорастания спор). Данный параметр хорошо коррелирует с концентрацией биоцидных препаратов в пропиточных растворах или лакокрасочных покрытиях. Исследования показали нецелесообразность проведения испытаний более 10 суток. Данного срока достаточно для выявления, способности материалов ингибировать рост плесневых грибов (частичного или полностью) или отсутствие у них фунгитоксичности.

Для удобства определения степени прорастания спор лучше использовать быстрорастущие виды с крупными темными спорами, у которых лаг-фаза в оптимальных условиях составляет 12–18 часов.

Изучение влияние биоцидных препаратов с различной концентрацией на развитие микромицетов различной видовой и штаммовой принадлежности, проведенное автором, выявило, что одни культуры чутко реагируют на повышение концентрации биоцида удлинением лаг-фазы, другие – отличаются высокой устойчивостью к антисептикам, заметная задержка прорастания спор у них наблюдается при сравнительно высокой токсичности материала.

В качестве тест-культуры можно использовать оба типа грибов. При необходимости быстрого отбора из большого количества образцов вариантов антисептической обработки, придающих материалам высокую фунгицидную активность, лучше использовать культуры, устойчивые к неблагоприятным воздействиям. Например, на 1 этапе отбора оставить варианты, где лаг-фаза резистентной культуры превышает 2 суток. При отработке технологических режимов, оценке устойчивости к внешним воздействиям и в других аналогичных исследованиях целесообразно использовать культуры, чувствительные к антисептикам.

Метод «агаровой сетки» позволяет количественно охарактеризовать фунгицидную активность материалов и в тех случаях, когда содержание антисептического препарата превышает минимальные ингибирующие концентрации. На практике антисептик нередко вносят с «запасом прочности», и выявить остаточную фунгицидную активность в том случае, когда рост и развитие грибов полностью ингибируется, довольно сложно. Химические методы могут определить лишь количество вещества, которое может находиться в активной или неактивной по отношению к живым организмам форме. В таких случаях критерием фунгитоксичности будет служить минимальное время контакта агаровой сетки с образцом вызывающее потерю жизнеспособности спор [18].