Методы оценки адаптации бактерий к антимикробным веществам

Выделение активируемых форм клеток и контроль за изменением уровня их чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам обеспечивается использованием методов выращивания микроорганизмов в агаре.

Для достижения вышеизложенной цели зачастую используются методы культивирования микроор­ганизмов в жидких и агаризованных средах в присутствии антисептиков. Для реализации данных методов в суспензию клеток микроорганизмов в питатель­ном бульоне вносят антимикробные вещества. Далее суспензию поме­щают в термостат при 30°С и культивируют в течение 3 сут. Каждые сутки отбирают образцы и высевают их на ПА для определения количе­ства выживших клеток.

При выращивании микроорганизмов на агаризованных средах с антисептиками прово­дят последовательный пересев колоний кле­ток, появившихся на питательном агаре (ПА) с биоцидными веществами умеренной концен­трации, на среды с возрастающей концентраци­ей антисептика. Для этого готовят чашки Петри с плотной агаризованной средой с со­держанием биоцидов и контроль­ные чашки без биоцидов. В каждую чашку вно­сят суспензию микроорганизмов и культиви­руют в термостате при 30°С в течение 3 суток, а затем подсчитывают количество выросших ко­лоний клеток, устойчивых к биоцидам.

Для получения вторичной и последующих культур клеток из чашек Петри, на которых был отмечен рост микроорганизмов, отбирают отдельные колонии клеток, вносятих в фи­зиологический раствор, выравнивают концен­трации по оптической плотности и высевают разведения на чашки с ПА, содержащими такие же и возрастающие концентрации биоцидов.

Полученные на разных стадиях пересевов клетки используют для оценки чувствитель­ности и устойчивости микроорганизмов к биоцидным веществам. Эти измерения проводят с помощью метода диффузии веществ в агар. На поверхность застывшего ПА наносят суспензию тест-культуры микроорга­низмов и равномер­но распределяют с помощью стерильного шпа­теля по поверхности агара. Затем укладывают стерильные диски фильтровальной бумаги диаметром 8 мм, пропитанные в растворах биоцидов. Чашки помещают в термостат при температуре (30 ± 1)°С на 24 ч. После инкубирования изме­нют диаметры зон задержки роста клеток вокруг дисков.

При оценке чувствительности и устойчивости клеток микроорганизмов к биоцидам используют также метод реплик. Вырос­шие колонии клеток переносят из чашек без биоцидов на питательный агар с возрастающим содержанием антисептика и определяют преде­льные концентрации, при которых не наблю­далось образование видимых колоний клеток.

В качестве антисептиков применяют препараты полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ), хлоргексидин биглюконат (ХГ).

Для обработки результатов измерения используют статистические методы.

Скорость адаптации клеток на популяционном уровне можно оценить по тангенсу угла наклона полученных в ходе анализа зависимостей изменения логарифма численности клеток от времени их культивирования по формуле:

v = d (log N) / dt, (4)

где N – численность культивируемых микроор­ганизмов, устойчивых к биоциду;

t – время культивирования клеток.

Предложенные методы устанавливают, что длительность периода адаптации клеток к биоциду ПГМГ зависит от его содержания в среде. При увеличении кон­центрации биоцида ПГМГ наблюда­ется задержка роста численности популяции клеток (лаг-фаза) более чем на двое суток до появле­ния культивируемой формы микроорганизмов. Этот период задержки роста характеризует фи­зиологический уровень адаптации клеток.

Как известно, жизнеспособность микроор­ганизмов при воздействии неблагоприятных факторов среды характеризуется чувствитель­ностью и устойчивостью клеток к этим факто­рам. О чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам можно судить по минимальной концентрации вещества, вызы­вающей задержку роста клеток. Торможение жизненной активности клеток рассматривается как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов.

Полученные на разных стадиях адаптации клетки могут быть использованы для оценки их чув­ствительности и устойчивости к биоцидам.

Существует максимальная концентрация антисептика, выше которой физиологическая адаптация микроорганизмов к нему невозмож­на ввиду превышения адаптационных возмож­ностей клеток. Данная концентрация характе­ризует границу физиологической устойчивости микроорганизмов к биоциду.

Вместе с тем для микроорганизмов возмож­на генетическая адаптация, связанная со слу­чайной комбинацией полезных мутаций, при­водящая к повышению устойчивости к биоци­ду. Этот процесс требует значительно более длительных периодов времени и может растя­гиваться на десятки лет.

Данные методы позволяют установить, что адаптация микроорганиз­мов к биоцидам сопровождается увеличением численности выживших форм клеток, снижением их чувствительности и повышением устойчиво­сти. Чем ниже концентрации септика, тем выше скорость адаптации микроорганизмов к неблагоприятному фактору. Существуют максимальные концентрации антимикробных веществ, выше которых клетки физически не адаптируются. Основными параметрами, характеризующими адаптационные свойства микроорганизмов, являются: скорость адаптации, период времени адаптации, чувствительности микроорганизмов к антисептикам, содержание устойчивых форм клеток.

Использование методов выращивания микроорганизмов в агаре позволяет выделят культивируемые формы клеток и следить за изменением их уровня чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам, а также определять содержание устойчивых форм клеток. Однако эти методы длительны, трудоемки и не позволяют анализировать некультивируемые формы клеток, содержание которых может достигать в природных условиях 90% всей численности популяции микроорганизмов.

Это вызывает необходимость разработки более эффективных инструментальных методов анализа адаптационных свойств микроорганизмов и определения содержания некультивируемых форм клеток [20].