Выделение чистых культур бактерий

Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур микроорганизмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Выделение чистых культур осуществляется в несколько стадий. Первая стадия – отбор и подготовка проб. На данной стадии может осуществляться количественный анализ содержания требуемых микроорганизмов в материале.

Второй стадией является получение элективной культуры. Необходимо отметить, что для достижения наилучших результатов при выделении микроорганизмов обычно добиваются при сочетании нескольких элективных факторов. К числу факторов относят физические (температуру, электромагнитные излучения, концентрация молекулярного кислорода, активность воды), химические (состав питательной среды, которую используют в качестве элективной, наличие в ней ингибиторов роста и биоцидов, а также реакцию среды) и биологические факторы (живые питательные среды, использование симбиотических партнеров).

Третья стадия – получение чистых культур микроорганизмов, в данном случае – бактерий. Чтобы из смешанной элективной культуры получить требуемый микроорганизм в виде чистой культуры, необходимо добиться разобщения клеток, после чего обеспечить условия, в которых образуется их потомство.

Существуют методы прямого выделения одной клетки при микроскопировании (их обычно применяют для относительно крупных микроорганизмов) и косвенные методы, основанные на плотных средах (с последующим формированием колоний) либо в жидких средах (с последующим формированием суспензий). Наиболее простым и чаще других используемым способом получения чистой культуры является чашечный метод Коха, который состоит в физическом разобщении клеток на плотной среде, в результате чего одна клетка формирует одну колонию, состоящую из генетически однородных особей – потомков единственной клетки.

Для разобщения клеток аэробных микроорганизмов используют следующие методы:

- посев методом Коха на поверхность плотной среды в одной чашке Петри. Для получения изолированных колоний элективную культуру следует развести. При этом бывает трудно предсказать относительное содержание в суспензии требуемых микроорганизмов, и поэтому обычно делают высевы из нескольких серийных разведений (чаще из разведений 10^-4–10^-6);

- посев методом Коха на плотные среды в трех чашках Петри. Этот способ обычно дает наилучшие результаты при высеве смешанных культур, то есть позволяет выявить наибольшее разнообразие морфологических типов колоний;

- посев истощающим штрихом. Данный метод выбирают в тех случаях, когда существует уверенность, что требуемый организм находится в элективной культуре в достаточно высокой концентрации.

Для получения изолированных колоний анаэробов выбирают:

- глубинный посев. Здесь требуется провести разведение элективной культуры. Обычно производят засев разведений 10^-4–10^-6;

- разведение суспензий в плотных питательных средах. Данный метод используют для облигатных анаэробов. Его суть состоит в том, что в пробирки для разведения элективной культуры вместо физиологического раствора вносят расплавленную агаризованную питательную среду, охлаждают ее до 45–46^оС, после чего совершают все манипуляции по разведению суспензии. Делают 6–10 последовательных разведений с шагом 10. Затем среду с пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (в соотношении 3:1) для защиты среды от проникновения воздуха.

Получение чистых культур прямым выделением клеток при микроскопировании. Методы данной категории требуют специального оборудования и не применимы для выделения очень мелких клеток и неклеточных существ:

- капельный метод Линднера позволяет выделять крупные клетки цианобактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, водорослей, простейших. Разводят элективную культуру в стерильной питательной среде с тем расчетом, чтобы в небольшом объеме (0,01 мл) содержались одиночные клетки (обычно получают разведения

10^-6–10^-8). На поверхность нескольких стерильных покровных стекол бактериологической петлей наносят микрокапельки разведенной суспензии. Готовят препараты «висячая капля» и просматривают под микроскопом. Отбирают те препараты, в которых присутствует по одной клетке, и инкубируют их во влажных камерах 12–24 ч. Затем вновь микроскопируют и растущие культуры бактериологической петлей переносят в жидкие или плотные питательные среды.

- выделение клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой устройство, которым оснащают микроскоп, позволяющее с помощью специальной микропипетки извлекать из суспензии одну клетку. Все действия осуществляются под микроскопом [19].