Определение лактоферрина

В основу метода положен метод Манчини, который основан на изменении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесе­нии исследуемой сыворотки молока, в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.

Подготовка к анализу:

1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агар «Дифко», приготовленный на 0,033М фос­фатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01%мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной в 60 раз и нагретой до этой же темпе­ратуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластинку помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смо­ченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.

2) Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и моло­ко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

3) Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика используют стандартный лактоферрин в концентрациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг./мл, разведенный в 0,033 М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1 М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.

Проведение анализа:

В слое агара с антисывороткой пробойникам вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл разведения стандартного лактоферрина. Лунки следующих рядов заполняют иссле­дуемыми молочными сыворотками в том же объеме. Агаровые пластины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 4-3 ч, затем окрашивают амидо-черным Б.

Обработка результатов:

С помощью чертежного измерителя или штангенциркуля измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный график зависи­мости логарифма концентрации стандартного лактоферрина в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации о антисывороткой.

На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диа­метры колец преципитации стандартным лактоферрином, а по оси ор­динат - известное количество лактоферрина, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой.

Определение концентрации лактоферрина в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.

у клинически здоровых коров после родов и в середине лактации количество лактоферрина составляет 53-65 мкг/мл, у больных маститом - 251-330 мкг/мл, к концу лактации (период запуска) оно возрастает до 481,9±34,5 мет/мл и 2559,0±170,4 мкг/мл соответственно.