Определение истинного лизоцима (мурамидазы)

а) Метод К. Шахани.

Подготовка к анализу:

1) Приготовление молочной сыворотки.

5 мл молока разводят равным объемом 0,5% раствора натрия хлорида и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Снимают слой жи­ра, молоко подогревают до 37°С и доводят рН до 4,6 1н раствором соляной кислоты. Выпавший в осадок казеин отделяют центрифугиро­ванием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.

2) Построение калибровочных кривых. Для построения калибровочных кривых используют кипяченое мо­локо, в котором таким способом подавляется лизоцимная активность, а затем из него готовят молочную сыворотку.

В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизированных клеток Мусгососсus 1уsоdеiсticus,изкоторых готовят суспензию на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,2, экстинция которых должна составлять 10-30% против дистиллирован­ной воды (100%).

В два ряда пробирок с сывороткой молока по 3 мл вносят раз­ные количества лизоцима (в первый ряд - от 0-20 мкг/100 мл, во второй - от 20-200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежепри­готовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют экстинцию (Д₀) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д₂₀). По разности экстинций (Д₀ и Д₂₀) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концент­рации лизоцима строят две калибровочные кривые.

Проведение анализа:

К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеп­риготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же опре­деляют на спектрофотометре экстинцию (Д₀) при длине волны. 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в тече­ние 20 мин и повторно определяют экстинцию (Д₂₀).

По разности экстинций Д₀ и Д ₂₀ по калибровочной кривой определяют концентрацию лизоцима.

б) По методу Парри в модификации Хавигера

1) Приготовление молочной сыворотки.

5 мл молока центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, снимают слой жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путем внесения 1н раствора соляной кислоты. Казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.

2) Приготовление суспензии тест-культуры.

Используют ацетоновый порошок убитой культуры Мусгососсus 1уsоdеiсticus, который вносят в 1/5 М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин.

К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведенной физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д₀ на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ста­вят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д₃₀).

Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:

Д₀-Д₃₀

уед = ——————,

где Д₀ - начальная оптическая плотность образца;

Д₃₀ - оптическая плотность через 30 мин;

30 - время инкубации образца в термостате, мин.

1 УЕА - изменение оптической плотности на 1 единицу за 1 мин одним мл сыворотки молока.

По данным Н.А. Сапожниковой (1992), в молоке клинически здо­ровых коров активность мурамидазы составляет 0,56±0,02 УЕ, а больных субклиническим маститом - 0,46±0,01 УЕ.

в) Метод П. А. Емельяненко и др.

1) Приготовление агаровых пластинок.

1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере расплав­ляют 15-20 мин на кипящей водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером 30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помощью тон­костенной металлической трубочки с наружным диаметром 5мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.

2) Приготовление обезжиренного молока.

Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-14 ч и снимают верхний слой с жиром.

3) Приготовление растворов лизоцима.

Стандартный лизоцим разводят в 1/15 М фосфатном буфере до концентрации1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.

Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной температуре 22-24°С и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.

Обработка результатов:

По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую в полулогарифмическом масштабе и с ее по­мощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.

г) Метод Оссермана в модификации Фараджи

Подготовка к анализу:

1) Приготовление агаровых пластинок.

1% раствор агара «Дифко» на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 60~70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры Мусгососсus 1уsоdеiсticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до по­лучения однородной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, что­бы получился слой агара толщиной 4мм. После застывания агара в нем делают луночки диаметром 1 см на расстоянии 1,5 см друг от друга.

2)Приготовление обезжиренного молока.

Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при темпе­ратуре 4-6°С в течение 24 ч, снимают верхний слой с жиром и раз­водят 1/15 М фосфатным буфером в соотношении 1:10.

3) Приготовление растворов лизоцима.

Стандартный лизоцим разводят в 1/15 М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.

Растворы стандартного лизоцима и пробы разведенного молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,1 мл, вы­держивают в термостате при 37°С в течение 36 ч и линейкой измеря­ют диаметры зон лизиса.

По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую и с ее помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.