Определение общих иммуноглобулинов

Методом с сульфатом натрия

Подготовка к анализу

1) Приготовление молочной сыворотки. пробу молока (молозива) центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллиро­ванной водой в 5-10 раз, подогревают до температуры 37°С и добав­ляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6, для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.

2) Приготовление 18% раствора сульфата натрия.

18 г обезвоженного сульфата натрия растворяют в 100 мл дис­тиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притертой крышкой.

В пробирку вносят 1,9 мл 18% раствора сульфата натрия, до­бавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки молока (молозива), тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм (синий светофильтр № 3) в кювете с рабочей гранью 5 мм относи­тельно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения опти­ческой плотности выше отметок 1,300-1,500 сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3 раза. Степень разведения учитывают при расчете конечных результатов.

По данным оптической плотности образцов сыворотки молока (молозива) с учетом степени разведения определяют концентрацию иммунных глобулинов по калибровочной таблице:

Таблица.4.

Калибровочная таблица

Оптичес­кая пло­тность	Содержание иммуногл, мг%	Оптичес­кая пло­тность	Содержание иммуногл., мг%	Оптичес­кая пло­тность	Сдержание иммуногл., мг%
0,01 12 0,15 191 0,65 730
0,02 28 0,16 203 0,70 790
0,03 35 0,17 214 0,75 840
0,04 46 0,18 225 0,80 890
0,05 57 0,19 236 0,85 950
0.06 69 0,20 247 0,90 1010
0,07 80 0,25 290 0,95 1060
0,08 91 0,30 340 1,05 1170
0,09 103 0,35 400 1,10 1230
0,10 114 0,40 450 1,15 1290
0,11 130 0,45 500 1,20 1340

а) Метод радиальной иммунодиффузии

В основу метода положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесе­нии исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.

Подготовка к анализу:

Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к иммуноглобулинам классов А, G, М.

3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1 М веронал-мединаловом бу­фере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотноше­нии 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентра­ция антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1 М веронал-мединаловом бу­фере с рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисыворот­кой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинках раз­мером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную иди пластмассовую П-образную рамку толщиной 1мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинками заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9 мл.

Приготовление молочной сыворотки:

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 80-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, до­водя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифуги­рованием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа:

В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл стандартной не разведенной и разведенной 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объемом по 2 мкл. Пластинки инкубируют во влажной камере в течение 24 ч при температуре 4°С, а пластинки с антисывороткой - к иммуноглобулину М-48 ч.

Обработка результатов:

После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципита­ции. По данным разведении стандартных сывороток строят калибро­вочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации. Для этого на полуло­гарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат - известное количество иммуноглобулинов (МЕ/мл или мг/мл), содержащиеся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки сое­диняют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.

Для определения уровня иммуноглобулинов в испытуемой молоч­ной сыворотке на оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципи­тации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина каждого клас­са, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.

По данным Н.А. Сапожниковой (1992), концентрация иммуногло­булинов класса G в молоке клинически здоровых коров составляет: после родов - 7,9710,31 мг/мл, в середине лактации - 1,78+0,09 мг/мл, в период запуска - 8,28+0,38 мг/мл, у больных субклиничес­ким маститом - 15,02+0,87,2,56+0,09 и 11,87+0,59 мг/мл, иммуноглобулинов класса М соответственна 0,3й±0,03, 0,14±0,01, 0,34±0,04 мг/мл и 0,53+0,04, 0,23+0,01 и 0,39±0,05 мг/мл.

б) Химический метод по Бадин и Раусселет.

1) Приготовление цинк-салицилового реактива.

1,875 сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилового натрия, доливают водой до 900-950 мл. Измеряют рН, доводят 0,1н раствором едкого натра до 7,3, после доводят раствор до 1 л в мерной колбе бидистиллированной водой.

2) Приготовление раствора кальция хлорида.

2 мл официального 10% раствора кальция хлорида (фиксанола) смешивают с 117 мл бидистиллированной воды.

3) Приготовление тимолового реактива.

Сначала готовят 10% раствор тимола на 96° спирте. Затем 1 мл спиртового раствора растворяют в 80 мл веронал-мединалового буфе­ра, встряхивают и.доводят до 100 мл.

4) Приготовление веронал-мединалового буфера.

2,76 г веронала растворяют в 1-литровой колбе в небольшом количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, после растворения определяют рН и доводят вероналом или мединалом до 7,5, раствор доводят до метки 1 л бидистиллированной водой.

5) Приготовление цинкового реактива.

0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллированной воды, доводят до рН 7,5 веро­налом или мединалом.

6) Приготовление раствора сернокислого аммония.

189,0 г сернокислого аммония и 29,3 натрия хлорида растворя­ют в 1 л бидистиллированной воды.

7) Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную иди соляную кис­лоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центрифугирова­нием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр. Доводят рН сы­воротки до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.

8) Построение калибровочных кривых.

Используют эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов классов А, G, М. К 1 мл эталонной сыворотки добавля­ют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и 1 мл разведении добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрически при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибро­вочные кривые зависимости величины оптической плотности от кон­центрации иммуноглобулинов А, G, М.

Проведение анализа:

1) Определение иммуноглобулина G.

в пробирку № 1 вносят 5 мл цинк салицилового реактива, до­бавляют 1,1 мл молочной сыворотки, выдерживают 1 мин и колориметрируют при длине волны 400-470 мл (синий светофильтр). В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр).

2) Определение иммуноглобулина М. В пробирку № 3 вносят б мл цинкового реактива, добавляют 0.05мл сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр).

3) Определение иммуноглобулина А.

В пробирку № 4 вносят 6 мл раствора сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470нм (синий светофильтр

Обработка результатов:

Для каждого класса иммуноглобулинов проводят расчет оптичес­кой плотности исследуемых растворов, а затем по калибровочной кривой с учетом этих данных определяют их количественное содержа­ние.

Иммуноглобулин G.

Д_G = Д₂ х 2 + Д₁

где Д_G - оптическая плотность иммуноглобулина G;

Д₂ - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке№ 2;

Д₁ - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в про­бирке № 1;

2 – коэффициент.

Иммуноглобулин M

Д_M = Д₃ х 2

где Дм - оптическая плотность иммуноглобулина;

Дз - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в про­бирке № 3;

2 – коэффициент.

Иммуноглобулин А.

Да= Д₄ х 2

где Да- оптическая плотность иммуноглобулина А;

Д₄ - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;

2 - коэффициент.