Гель-фильтрация при высоком давлении

В качестве матриц для гель-фильтрации при высоком давлении используют крупнопористые силикагели, покрытые “гликофазой” (т.е. обработанные глицерилпропилсиланом) для подавления сорбции на поверхности силикагеля. Эти матрицы выпускают в виде сферических гранул диаметром 5 и 10 мкм. С переходом к использованию гранул таких размеров можно ожидать повышения разрешающей способности гель-фильтрации в режиме фракционирования макромолекул. Соответственно должны увеличиться рабочие давления и скорости элюции [1].

Достоинства гель-фильтрации

Гель-фильтрация незаменима для разделения молекул, отличающихся по молекулярным массам, по следующим причинам:

· Хроматографическое поведение практически всех веществ в геле не зависит от температуры, рН, ионной силы и состава буфера, разделение можно проводить почти в любых условиях.

· Так как адсорбция практически отсутсвует, очень лабильные веществ не изменяются в ходе гель-фильтрации. Это очень существенно, так как некоторые ферменты инактивируются или изменяют свои свойства при связывании с адсорбирующей поверхностью или ионообменной смолой.

· Уширение зон в гель-фильтрации меньшее, чем в других хроматографических методах.

· Объём элюирования находится в прямой зависимости от молкулярной массы [4].

ГЛАВА 2. ПРИМЕНЕНИЕ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ

Обессоливание растворов и смена буфера

Обессоливание с помощью гель-фильтрации широко используется для удаления сульфата аммония из растворов белков, удаления фенола из растворов нуклеиновых кислот, для отделения моносахаридов от полисахаридов и аминокислот от белков или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии. Обессоливание проводят с помощью колонки, заполненной сефадексом G-25. Фракции высокомолекулярных соединений элюируются с внешним объёмом колонки, в то время как фракции, содержащие низкомолекулярные соединения, распределяются между подвижной и неподвижной фазами и поэтому движутся с меньшей скоростью [3].

Смена буфера достигается простым пропусканием раствора макромолекул через колонку, предварительно уравновешенную другим буфером. Поскольку макромолекулы движутся через гель с большей скоростью, чем компоненты исходного буфера, они будут элюироваться буфером, которым была уравновешена колонка [4].