Другие системы клонирования

Необходимость в разработке других систем клонирования кро­ме клеток Е. coli продиктована главным образом желанием ис­пользовать для производства генно-инженерных продуктов тра­диционные промышленные микроорганизмы. К ним в первую очередь относятся грамположительные виды бактерий, синтези­рующие различные хозяйственно важные вещества: бациллы (протеазы и амилазы), актиномицеты (антибиотики) и коринебактерии (аминокислоты, стероиды). Из грамотрицательных клеток отметим псевдомонады, способные вести биодеградацию органи­ческих отходов.

Векторы, предназначенные для работы в других (кроме Е. coli) системах клонирования, делают, как правило, челночными, при­давая им способность реплицироваться дополнительно и в клетках Е. coli. Это дает возможность использовать хорошо изу­ченную систему для начальных этапов конструирования рекДНК и ее размножения в количествах, достаточных для трансформации исследуемых бактерий, а уже экспрессию клонированных генов вести в исследуемой системе. Основная трудность при разработке новых систем клонирования — отсутствие надежного способа вве­дения ДНК в клетки. Плазмиды могут просто не проникать в клетку или разрушаться в ней клеточными системами рестрикции, они могут не обнаруживаться из-за отсутствия экспрессии репликационных или селективных генов.

Векторы грамотрицательных бактерий. Применение опи­санных ранее векторов ограничено клетками Е. coli и такими близкородственными им энтеробактериями, как Salmonella, Proteus, Serratia. Векторы для других грамотрицательных бактерий конструи­руют, используя плазмиды с широким кругом хозяев, относящихся к группам несовместимости Р, Q и W. Как уже отмечалось, эти плазмиды реплицируются почти во всех грамотрицательньгх бак­териях, включая промышленно важные штаммы Agrobacterium, Azotobacter, Methylophilus, Neisseria, Pseudomonas, Rizobium и др. Наи­более характерные представители перечисленных групп — плазмиды RP4, RSF1010 и Sa (29,6 т.п.н.), соответственно. Плазмида RP4 имеет единственные сай­ты рестрикции в своих селективных генах Ap^R и Km^R, но из-за боль­шого размера не используется в качестве вектора. Вектором является, например, ее производная плазмида pRK2501, у которой есть сайты клонирования в генах Km^R (XhoI и HindIII) и Tc^R (SalI), a также единственные сайты ЕсоRI и BglII. У этого вектора отсутствует способность к конъюгации и мобилизации, поэтому его перенос воз­можен только методом трансформации.

Плазмида RSF1010 мультикопийна, неконъюгативна и невелика по размеру, но в ее селективных маркерах нет единственных сайтов рестрикции, поэтому она неудобна для клонирования генов. Для этой цели применяют ее производные, их которых первыми были предло­жены векторы серии рКТ. Преимущество описываемых векторов состоит в том, что нет необходимости делать их челночными. С их помощью вначале мож­но осуществлять предварительные операции по клонированию в хорошо изученных генетических системах (напри­мер, Е. coli), а затем отобранными клонами рекДНК про­водить трансформацию клеток других видов. Недостаток этих векто­ров — их нестабильность, которая вызвана тем, что гены, отвечающие за стабильность, разбросаны по всему плазмидному геному и часть из них отсутствует в векторах. Другой недостаток — разный уровень экспрессии плазмидных генов в разных клетках, что влияет на число копий плазмид, уровень синтеза чужеродного продукта и на эффективность выражения селективных маркеров.

Конечно, конструируют и челночные векторы. Например, век­тор pUCPIS, сконструированный на базе плазмиды pUCIS и репликатора одной из плазмид P. aeruginosa, стабильно поддерживает­ся в кишечной палочке и клетках псевдомонас.

Большинство грамотрицательных клеток можно трансформи­ровать после их обработки на холоду хлористым кальцием, но достигнутая эффективность трансформации существенно ниже, чем у Е. coli. Используют также трансформацию протопластов в при­сутствии полиэтиленгликоля. Но наиболее универсален метод элек­тротрансформации.

Векторы Bacillus subtilis. Клетки В. subtilis, будучи почвенны­ми микроорганизмами, обладают хорошо развитым аппаратом сек­реции продуктов метаболизма и выделяют в ростовую среду такие промышленно важные ферменты, как, например, амилазы, β-лактомазы, протеазы и др. Секреция чужеродных белков существенно облегчает их выделение и очистку, а, кроме того, иногда являются единственным средством их спасения от деградации внутри клетки.

При создании системы клонирования для В. subtilis первона­чальные трудности были связаны с тем, что большинство ее плаз­мид не несет селектируемых признаков. Однако оказалось, что некоторые мультикопийные плазмиды золоти­стого стафилококка, содержащие гены устойчивости к различным антибиотикам, способны трансформировать клетки В. subtilis, стабильно в них реплицироваться и экспрессировать эти гены. К ним относятся плазмиды рЕ194, рС194 и рТ127. Кроме селективных маркеров эти плазмиды обладают единственны­ми сайтами рестрикции и поэтому иногда используются в качестве векторов. Однако, как уже указывалось, удобные для работы векто­ры имеют два селективных маркера, причем хотя бы в одном из них должен содержаться единственный рестрикционный сайт. Такие век­торы были созданы на основе ряда вышеперечисленных плазмид.

Недостатком ранних векторов была их функциональная и струк­турная нестабильность. Функциональная нестабильность была выз­вана тем, что использовались репликаторы, не специфичные для В. subtilis. Репликатор, взятый из криптической бациллярной плазмиды существенно повысил стабильность векторов. Структурная нестабильность (появление делеций в клонируе­мой ДНК) — следствие способа репликации использовавшихся плазмид. Репликация по механизму катящегося кольца сопровождает­ся образованием однонитевых ДНК, а такая ДНК рекомбиногенна. Выделение реплирующихся в тета-форме плазмид позволило со­здать на основе их репликаторов векторы, стабильно клонирую­щие ДНК размером до 33 т.п.н. На базе ДНК умеренного фага F105 сконструи­рованы фаговые векторы, позволяющие клонировать чужДНК раз­мером до 5 т.п.н. и экспрессировать их. Принципы конструирования и способы клонирования сходны с теми, которые описаны для фага λ.

Трансформация клеток В. subtilis. Как уже отмечалось, трансформируемость клеток В. subtilis — их природное свойство, по­этому они легко трансформируются гомологичной бактериальной ДНК. Добавленная двунитевая ДНК адсорбируется на поверхнос­ти компетентных клеток и под действием нуклеаз превращается в однонитевые фрагменты. В клетки проникает однонитевая ДНК размером около 10⁴ нуклеотидов, которая путем рекомбинации за­мещает однонитевой гомологичный участок хромосомной ДНК, при этом почти каждый поглощенный фрагмент ДНК интегриру­ется в хромосому. Частота трансформации линейно зависит от концентрации добавляемой ДНК в определенных ее пределах. Это свидетельствует о том, что одной молекулы ДНК достаточно для успешной трансформации клетки.

Начальные этапы процесса трансформации клеток бактери­альной и плазмидной ДНК одинаковы, но во втором случае эф­фективность трансформации (нефракционированными препарата­ми плазмид) падает в среднем на три порядка, причем она оказалась зависящей от степени олигомеризации плазмид. Так, для мономерных кольцевых молекул она равна 40 трансфор­мантам на 1 мкг ДНК, для димерных — 10⁴, а для мультимерных — более 10⁵. Это объясняется тем, что проникшие в клетки однонитевые линейные фрагменты мономерной плазмидной ДНК не могут образовывать двунитевые кольцевые молекулы, способ­ные к репликации.

Указанный недостаток устраняется использованием для транс­формации мультимерных плазмид или созданием in vivo условий для закольцовывания мономерных однонитевых ДНК.

Векторы Streptomyces. Грамположительные почвенные бакте­рии рода Streptomyces производят свыше 60 % известных антибио­тиков и обладают собственными плазмидами и фагами. Неудиви­тельно поэтому, что для этих клеток достигнут существенный прогресс в разработке систем клонирования. Векторы обычно конструируют на базе низкокопийных плазмид SCP2 (30 т.п.н. из S. coelicolor) и SLP1 (17 т.п.н. из S. lividans). Все плазмиды конъюгативны. Однако у мультикопийных плазмидных векторов гены, отвечающие за конъюгативность, обычно делетированы, чтобы избежать возможности неконтролируемого обмена рекомбинантными ДНК между клетка­ми в смеси трансформантов. В качестве селективных маркеров ис­пользуют гены, обеспечивающие устойчивость клеток к различным антибиотикам. Наиболее распространенным маркером является ген tsr (устойчивость клеток к тиострептону).

Для клонирования в стрептомицетах сконструированы раз­личные типы векторов: клонирующие, экспрессионные, космидные, интегративные и др. С целью прямой селекции искомых трансформантов гены вне­дряют без собственного терминатора транскрипции в полилинкер, расположенный перед геном пео (устойчивость к канамицину), у которого нет промотора. Внедрение осуществляют в одинаковом направлении с геном пео. Селекцию ведут по признаку устойчи­вости трансформантов к канамицину, так как благодаря последо­вательности Шайна—Далгарно, находящейся в конце полилинке­ра, в клетках, содержащих рекДНК, ген пео экспрессируется. В клонирующих векторах для поис­ка рекомбинантных плазмид обычно используют ген тирозиназы mel, инактивация которого приводит к изменению окраски коло­ний трансформантов. Плазмидные векторы Streptomyces делают, как правило, чел­ночными, чтобы все предварительные операции по клонированию осуществлять в клетках Е. соli. Второй репликатор берут обычно из плазмиды pACYC184, так как он более стабилен в клетках стрептомицетов, чем репликатор pBR322.

Фаговые векторы стрептомицетов конструируют главным об­разом на базе ДНК умеренного фага рС31. Значи­тельная часть его генома (до 10 т.п.н.) может быть удалена и ис­пользована для целей клонирования без нарушения его способности к вегетативному развитию. В фаговые головки упаковывается ДНК размером от 36 до 43 т.п.н., поэтому максимальная емкость фаговых векторов (с учетом присутствия в них селективных маркеров и полилинкера) равна 9—10 т.п.н.

Кроме электротрансформации для введения ДНК в клетки стрептомицетов используют трансформацию их протопластов в присутствии полиэтиленгликоля. Эффективность этого процесса — около 10⁷ трансформантов на 1 мкг суперскрученной плазмидной или линейной фаговой ДНК. В опытах по клонированию эта ве­личина падает на два—четыре порядка.