Гибридные векторы

К гибридным векторам условно относят векторы, которые сочетают в себе все или отдельные свойства плазмидных и фаговых векторов.

Фагмиды. Фагмидами называют плазмидные векторы, содер­жащие ori- сайтнитевидных фагов. Из векторов этого типа наибо­лее часто используются плазмиды серии pEMBL, pUC118/119 и Bluescript M13. Они образованы внедрением в векторы pUC фрагмента ДНК фага f1 или М13, содержащего сайт рас, необходимый для морфогенеза фаговых частиц, и сайты ori(+) и ori(-). В присутствии фага-помощника fl (или М13) фагмиды, ис­пользуя сайт ori(+), начинают реплицироваться как фаговые ДНК, образуя однонитевые копии плазмид, причем выбор нити для ко­пирования зависит от ориентации ori-сайта. Образовавшиеся од­нонитевые ДНК могут упаковываться in vivo в капсулу и одновре­менно с фагом-помощником покидать естественным путем клетку.

Таким образом, с помощью фагмид клонируемый фрагмент может быть получен и использован в одно- или двунитевой фор­ме. Их преимущество перед векторами М13mр — возможность клонирования в них относительно больших фрагментов ДНК (до 10 т.п.н.), не подвергающихся внутренним перестройкам.

Космиды. Как уже отмечалось, емкость векторов, получен­ных на базе ДНК фага λ (не более 23 т.п.н.), ограничена тем, что существенную их часть составляют гены, кодирующие структур­ные белки фага. Как выяснилось, в головку этого фага может упаковаться любая ДНК подходящего размера (36—52 т.п.н.), ог­раниченная двумя cos-сайтами, ориентированными в одном на­правлении. Это позволило, совместив в одном геноме плазмидный репликатор и cos-сайт фага λ, создать векторы нового типа, так называемые космиды. Размер космид в сред­нем составляет 5 т.п.н., что позволяет с их помощью клонировать ДНК размером до 45-47 т.п.н. Поэтому космиды предназначены для конструирования банков генов.

Космиды фактически представляют собой автономные cos-сайты. Использование их для клонирования генов основано на том, что в линеаризованной форме они могут присоединяться к обоим концам фрагментов чужДНК и образовывать структуры типа конкатемерных молекул ДНК. Такие молекулы способны упако­вываться in vitro в головки фага λ, если, конечно, cos-сайты нахо­дятся в одинаковой ориентации и размер ДНК между ними не превышает 52 т.п.н. Инъецированные в клетки рекомбинантные молекулы ДНК циркуляризуются через cos-сайты и автономно реплицируются. В присутствии фага-помощника они могут быть упакованы in vivo в фаговые головки и после лизиса клеток ото­браны в виде фаговых частиц.

Обычно космиды конструируют на базе плазмиды pBR322. Тех­ника клонирования генов с их помощью заключается в следующем. Космиду линеаризуют рестриктазой через сайт клонирования и смешивают ее с чужДНК, подвергнутой частичному гидролизу с помощью рестриктазы, образующей одинаковые липкие концы с вектором. В результате образуются продукты разного строения. Из них к упаковке способны только такие фрагменты чужДНК, которые несут на обоих концах космиды, находящиеся в одной ориентации. Следовательно, уже на этапе упаковки осу­ществляется отбор рекДНК. Реконструированными in vitro фагами инфицируют бактериальные клетки, а клоны, содержащие рекомбинантные космиды, отбирают по селективным маркерам. При этом образуется в среднем 10⁶ клонов из 1 мкг чужДНК. Несмот­ря на мультикопийность исходных космид, число копий рекомбинантных космид на клетку не превышает нескольких единиц. По­этому содержащие их бактериальные клоны необходимo поддерживать в селективных условиях. Главные преимущества космид: 1) передача рекДНК в клет­ки инфицированием гораздо эффективнее, чем трансформацией; 2) в инфицированные клетки проникают в основном рекомбинантные молекулы ДНК; 3) происходит селекция больших кло­нируемых фрагментов (30—45 т.п.н.), в то время как при транс­формации отбираются главным образом плазмиды меньшего размера. Последнее особенно важно при создании банка генов и при необходимости клонировать и анализировать эукариотические гены больших размеров.

Однако космидам присущи и серьезные недостатки. Первый — возможность объединения в одной рекомбинантной космиде двух или более фрагментов чужДНК, не располагающихся рядом в ис­ходном геноме, что затрудняет правильную интерпретацию выво­дов о структуре генов. Во избежание этого перед клонированием необходимо дефосфорилировать фрагменты чужДНК и/или ото­брать фракцию размером 30—45 т.п.н. Первый способ делает не­возможным объединение фрагментов ДНК друг с другом, а второй препятствует упаковке слишком больших рекомбинантных космид. Другой недостаток — нестабильность рекомбинантных космид, причем внутримолекулярные делеции образуются даже в rесА^- штаммах. Он устраняется использованием клеток Е. coli recBCsbcBrecJ. Наконец, наблюдается сравнительно высокий фон мультимерных векторных молекул, который затрудняет поиск рекомбинантных клонов. И в этом случае рекомендуется дефосфо­рилировать линеаризованные космиды, что предотвратит их объе­динение. Однако, требуются специальные методы, чтобы лигировать вектор и чужДНК, если оба компонента дефосфорилированы.

Современные космиды имеют полилинкеры, по краям кото­рых расположены сайты для редкощепящих рестриктаз с целью "вырезания" клонированных фрагментов, или фаговые промоторы с целью получения транскриптов с концевых участков вставок. Транскрипты используют в качестве зондов в методе "прогулки по хромосоме". Сконструированы также космиды, со­держащие эукариотические ori-сайты и селективные маркеры; они предназначены для работы с клетками животных. От­метим, однако, что в связи с техническими трудностями космиды применяют все реже.

Фазмиды. О природных фазмидах, сочетающих в себе свой­ства фагов и плазмид, уже упоминалось. В фазмидных векторах искусно сочетаются положительные свойства фаговых и плазмидных векторов. Один из первых таких векторов — фазмида λpMYF131. Размер фаз­миды (33,3 т.п.н.) не допускает ее упаковки в головку фага λ, поэтому для наработки векторной ДНК используют плазмидный репликатор, а само это свойство применяют для отбора рекомбинантных фазмид в виде фаговых частиц, реконструированных in vitro. Емкость вектора λpMYF131 — 4,4-19,6 т.п.н., что позво­ляет привлекать его для получения банков генов. Выход рекДНК достигает 3х10⁶ фаговых клонов на 1 мкг векторной ДНК. Рекомбинантные фазмиды можно отбирать и в составе бактериальных клонов, инфицируя ими λ-лизогены и отбирая трансдуктанты на среде с ампициллином.

Фазмидные векторы так же как и фаговые, используют для клонирования кДНК и геномной ДНК. Эффективность упаковки рекомбинантных фазмид в фаговую головку с последующим инфицированием клеток Е. coli превосходит эффективность транс­формации бактерий плазмидами в 100 раз. Это существенно об­легчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клонов, повышая тем самым вероятность изолирова­ния редких клонов. И сам процесс скрининга в данном случае также существенно облегчен, так как рассев фагов на чашки мо­жет проводиться с высокой плотностью, а фон "ложных ответов" обычно мал. Однако большой размер фаговых и фазмидных векторов затрудняет рестрикционный анализ клони­рованных генов и их секвенирование, так что после нахождения нужного клона вставку, как правило, переносят в плазмидный вектор. Эта процедура методами in vitro отнимает много времени. От нее избавляет оригинальный фазмидный вектор λZAP, который обладает уникальной способностью исключать in vivo содержащуюся в нем плазмиду вместе с клони­рованными генами. Он используется главным образом для клонирования и эксп­рессии кДНК.