Фаговые векторы

Напомним, что фаговые векторы конструируют на базе ДНК фагов с таким расчетом, чтобы в них сохранилась информация, которая обеспечивает сборку in vivo фаговых частиц. Для клонирования в клетках Е. coli такие векторы разработаны на базе ДНК фагов λи M13. В первом случае фаговые головки имеют строго определенную геометрию, так что векторы способны включать та­кое количество чужДНК, чтобы образовавшиеся рекДНК могли упаковаться в головки фага. По этой причине векторы характери­зуются своей емкостью. Для нитевидных фагов, к которым отно­сится М13, понятие емкости не применимо, величина клонируе­мой в них ДНК определяется требованиями эксперимента к стабильности фаговых частиц.

Векторы, сконструированные на основе ДНК фага λ. Фагу λ самой природой была уготована роль переносчика чужих генов in vivo и in vitro. Действительно, в середине его генома имеется область, несущественная для развития фага. Она замещается на бактериальные гены при образовании трансдуцирующих фагов и она же используется для внедре­ния чужДНК в вектор методами in vitro.

Фаговые векторы подразделяются на векторы внедре­ния и векторы замещения. Первые несут один сайт узнавания для избранной рестриктазы, поэтому у них, как и у плазмидных векторов, длина рекДНК равна сумме длин вектора и клонируемого фрагмента. Векторы замещения имеют два сайта узнавания для используемой рестриктазы, поэтому в такие векто­ры клонируемые фрагменты ДНК вставляют вместо участков, ог­раниченных данными сайтами. В обоих случаях в реакциях обра­зования рекДНК участвуют два фрагмента λ ДНК (левое и правое плечи векторного генома, имеющие на одном из своих концов соs-сайт) и фрагмент чужДНК. Под действием лигазы благодаря соs-сайтам прежде всего объединяются разные плечи λ ДНК. За­тем образовавшиеся векторные молекулы реагируют с чужДНК и друг с другом, формируя конкатемеры. Они являются субстратом при сборке фаговых частиц in vitro.

Емкость фагового вектора, т.е. теоретически наи­больший размер чужДНК, вставляемой в него, вычисляется как разность между максимальной величиной молекулы ДНК, упа­ковываемой в головку фага λ, (она равняется 52 т.п.н.), и мини­мальной величиной генома фага, необходимой для его развития. Последняя, в свою очередь, подсчитывается как разность между длиной ДНК (48,5 т.п.н.) и суммарной длиной областей, несуще­ственных для развития фага. К ним относится область в центре генома между генами J и N размером 16 т.п.н. и область nin меж­ду генами Р и Qразмером 3,5 т.п.н. Таким образом, минимально возможный размер векторов, сконструированных на основе λ ДНК, 29 т.п.н. (48,5 - 16 - 3,5), а максимальная величина вставки (тео­ретическая емкость) 23 т.п.н. (52 - 29).

Реальная емкость вектора определяется не только его разме­ром, но и минимальной величиной ДНК, которая может упако­ваться в фаговую головку (36 т.п.н.). Поэтому вводятся понятия максимальной и минимальной емкости фаговых векторов. Под этими понятиями подразумевается максимальное и минимальное количество ДНК, которое можно клонировать в векторе. Эти ве­личины определяются как разность, соответственно, между макси­мальным или минимальным размером упаковываемой ДНК и сум­марным размером плеч вектора. Например, если у вектора сумма плеч равна 34 т.п.н., то в нем можно клонировать фрагменты ДНК размером от 2 (минимальная емкость) до 18 т.п.н. (максимальная емкость). Отметим, что если в последнем примере вектор является вектором внедрения, то он не образует жизнеспособных фагов, а рекДНК, сделанная на его основе, образует. Это обстоятельство можно использовать как фактор прямой селекции рекомбинантных фагов, несущих вставки чужДНК.

Отбор фагов, содержащих только рекДНК, ведут методом пря­мой или непрямой селекции.

Стратегию конструирования фаговых векторов мож­но рассмотреть на примере создания первых векторов, предназначенных для работы с рестриктазой EcoRl. В ДНК фага λ дикого типа имеется 5 EcoRI-сайтов, причем три из них располагаются в центральной области, где локализованы несу­щественные гены, а два сайта затрагивают важные гены. Конечно, сайты рестрикции, используемые для клонирования, не должны затрагивать существенные гены. Поэтому авторы отобрали жизнеспособные варианты фагов, у которых два последних сайта были изменены. На их основе были созданы векторы серии λgt (general transduction), причем для увеличения их емкости в них была внесена делеция nin5 размером 2,8 т.п.н.

В базовой конструкции λgt отсутствуют центральные фрагмен­ты В (4,8 т.п.н.) и С (5,5 т.п.н.), поэтому ее, казалось бы, можно было использовать как вектор внедрения. Размер такого вектора (48,5 -2,8 - 4,8 - 5,5 = 35,4 т.п.н.) был бы недостаточен для упаковки в фаговую головку, что давало бы возможность прямого отбора рекДНК в виде фаговых частиц. Однако на практике подобные векторы мож­но использовать, если только предлагаются способы наработки их ДНК. Известны два таких способа — внедрение в вектор плазмидного репликатора или буферных фраг­ментов, увеличивающих его до размеров, которые обеспечивают упа­ковку вектора в головку фага.

Кроме векторов, приспособленных для работы с рестриктазой EcoRI, во второй половине семидесятых годов были созданы векторы и для многих других рестриктаз. Принципы их конструирования сходны с вышеописанными. Например, широкое распространение получили векторы-хароны, на­званные так по имени мифического перевозчика через реку Стикс. Для удаления из правого плеча харонов нежелательных сайтов рест­рикции были использованы аналогичные по функциям участки ДНК других лямбдоидных фагов, а также различные делеции. В централь­ной части замещения, делеции, дупликации и вставки подбирались так, чтобы ввести в векторы нужные сайты рестрикции. В результате с помощью полученных векторов можно клонировать фрагменты ДНК разной длины, используя при этом различные рестриктазы. Всего было сконструировано несколько десятков харонов.

Более универсальны благодаря сайтам поликлонирования векторы λ2001 и λDASH, которые также предназначены для конструирования геномных библиотек. Их емкость 10—22 т.п.н. Промоторы фагов Т3 и Т7, имеющиеся на концах полилинкеров у вектора λDASH, позво­ляют транскрибировать любую из нитей встроенного фрагмента ДНК. Полученные транскрипты можно использовать для "прогу­лок по хромосоме" с целью генетического картирова­ния. Отбор рекомбинантных фагов ведут по Spi^- фенотипу, ис­пользуя рекомендуемый штамм NM539.

Векторы, созданные на базе ДНК нитевидных фагов. Близко­родственные нитевидные колифаги М13, fl и fd обладают однонитевой кольцевой ДНК, состоящей из 6,4 тыс. нуклеотидов, и име­ют ряд свойств, позволяющих использовать их в качестве векторов. Во-первых, в их ДНК между генами II и IV есть межгенный участок (спейсер), в который можно вставлять чужеродные гены. Во-вторых, размер капсиды зависит от длины упа­ковываемой молекулы ДНК, что позволяет клонировать фрагмен­ты ДНК размером до 15 тыс. нуклеотидов. В-третьих, они образуют фаголизаты с высокой концентрацией (до 10¹² частиц в 1 мл) и, таким образом, позволяют получать большие количества вектор­ной и клонируемой ДНК.

Преимущества однонитевых векторов являются следствием особенностей развития нитевидных фагов. Генно-инженерные операции с однонитевыми векторами и процедуры по их конструированию ведутся, конечно, с использо­ванием двунитевых репликативных форм (РФ) ДНК. Создание подобных векторов сводится к введению в спейсеры единичных сайтов рестрикции, а также селективных маркеров. Основная осо­бенность этих векторов — возможность работать с ними и как с плазмидами, используя РФ ДНК, и как с фагами. Доступность клонируемых генов сразу в одно- и двунитевой формах значи­тельно облегчает их структурный и функциональный анализ. По­лучение клонированных генов в однонитевой форме необходимо для секвенирования генов по Сэнгеру, для сайт-специфического мутагенеза и для приготовления гибридизационных зон­дов. Главный недостаток однонитевых векторов — нестабильность клонируемых в них чужДНК, обусловленная тем, что фаги с боль­шими вставками развиваются медленнее. Поэтому уменьшение их длины является фактором селекции.

Широкое распространение получили векторы серии М13mр, созданные в 1977—1983 годах в лаборатории Мессинга, в которых селективным признаком для отличия вектора от рекДНК служит фенотип Lac⁺ или Lас^-трансфицированных клеток.

Введение в бактерии векторов типа М13mр осуществляют трансфекцией клеток Е. coli кальциевым методом, причем двунитевая ДНК трансфицирует более эффективно, чем однонитевая. Клетки, инфицированные нитевидными фагами, продолжают де­литься, поэтому из негативных колоний можно выделять жизне­способные клетки, содержащие фаги.