Лабораторная работа № 18

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА

Ц е л ь р а б о т ы - определить активность трипсина фотоколориметрическим методом.

Трипсин - пищеварительный протеолитический фермент, гидролаза, компонент панкреатического сока, катализирует протеолиз. Трипсин гидролизует белки, поступающие в тонкий кишечник.

Активаторы трипсина - трипсин, энтерокиназа. Оптимум рН - 7,8-8,2. Профермент трипсина - трипсиноген.

Определение протеолитической активности трипсина основано на количественном определении тирозина, образующегося при гидролизе казеина. Казеин - белок молока. При взаимодействии тирозина с фенольным реактивом образуется комплекс синего цвета, содержание которого определяется фотоколориметрически при длине волны 630-690 нм, рабочей длине кюветы 0,5 см.

Оборудование, реактивы:

ФЭК; пробирки; фильтры; воронки; пипетки; термостат (37 ⁰С); казеин; буфер фосфатный (0,1%-й раствор, рН = 8,0); ТХУ (10%-й раствор); реактив фенольный; NaOH (0,5 моль/л раствора).

Материал для исследования: 5_*10^-4%-й раствор трипсина в 0,005 моль/л раствора HCl.

Порядок выполнения работы:

1. Постановка ферментативной реакции.

В двух пробирках готовят инкубационные смеси следующего состава (табл. 16).

Таблица 16

Проба	Раствор казеина, мл	Фосфатный буфер, мл	Раствор ТХУ, мл	Раствор трипсина, мл
Опытная		1,5	-	0,5
Контрольная		1,5		0,5

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в термостате при 37 ⁰С в течение 20 мин. По окончании инкубации в опытную пробу для прекращения реакции добавляют 3 мл 10%-го раствора ТХУ, перемешивают. Через 5-10 мин обе пробы фильтруют через бумажный фильтр.

П. Определение концентрации тирозина.

В две пробирки наливают по 5 мл 0,5 моль/л раствора HCl, затем в одну наливают 2,5 мл полученного фильтрата контрольной пробы, в другую - 2,5 мл фильтрата опытной пробы, в обе пробирки добавляют 0,5 мл фенольного реактива. Смесь тщательно перемешивают до появления синей окраски. Через 20 мин определяют на ФЭКе оптическую плотность (длина волны 630-690 нм). Находят разность между оптической плотностью опытной и контрольной проб. По калибровочному графику определяют содержание тирозина в растворе в результате ферментативного гидролиза казеина.

Ш. Расчет активности трипсина.

Рассчитывают активность трипсина в единицах на 1 мл раствора фермента, удельную активность (в расчете на 1 мг белка).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА