По разнообразию методических приемов, по крайней мере

7В

Рис. II, Блок-схемы ковалентной иммобилизации фер­ментов

за счет сшивающегося агента, этот способ несравнимо богаче и гибче предыдущего. Во-первых, подбором длины сшивающего агента (или подбором оптимальной смеси сшивающих агентов различной длины) можно изменять каталитические характе­ристики иммобилизованного фермента. Во-вторых, можно спе­циально конструировать сшивку так, чтобы она содержала связь, лабильную в определенных условиях или специфически расщепляемую определенными реагентами (в частности, фер-ментативно). Это дает ключ к контролируемому отделению им­мобилизованного фермента от носителя, например, при решении проблем направленного транспорта ферментов в живом ор­ганизме.

Целый ряд разнообразных решений задачи ковалентной им­мобилизации ферментов дает использование систем, изначаль­но не содержащих носителя, а только фермент и сшивающие агенты, где носитель {как твердое тело) формируется непосред­ственно в процессе иммобилизации или же сам фермент служит одновременно и носителем. Речь, таким образом, пойдет здесь о ковалентном вшивании молекулы фермента в различные типы сеток (рис. II, в). Идея конструирования ферментных сеток (ретикуляция ферментов) вытекает из «олифу нкиионалышй при­роды самой молекулы фермента, имеющей на поверхности по-

мимо активного центра достаточно большое количество реак-ционнеспособных групп. При введении в раствор фермента би­функционального сшивающего агента отдельные молекулы фер­мента сшиваются друг с другом и образуют более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, е которой узлами служат сами молекулы фермента. В зависимости от природы и количе­ства сшивающего агента можно получить как водорастворимые, так и водонерастворимые препараты.

Другой прием ретикуляции основан на использовании фер­ментов, предварительно ковалентно модифицированных реаген­том, содержащим двойную связь, например акрилоштхлоридом, В этом случае при сополимернзации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с акрил амидом) образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером (например, N_T N-мети-лен-бис-акриламидом). В рассматриваемой системе исходное состояние — жидкий раствор, а конечное (после полимериза­ции) — твердое тело (гель), причем, естественно» оно приобре­тает форму того сосуда (реактора), в котором проводится поли­меризация. Целенаправленное использование этого явления положено в основу целого ряда оригинальных способов им­мобилизации. Сшивкой белка в объеме растворителя (сополи-меризацией) получают трехмерный гель (рис. 12, а) в виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать и использовать в виде более или менее мелких частиц в суспензиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредст­венно в виде мелких частиц сферической формы путем эмульси­онной полимеризации. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Предельный вариант таких систем — микроэмульсии, или гндратированные обращенные ми­целлы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. В мицеллярыых системах размеры «капелек», со­держащих модифицированный фермент и мономеры, можно варьировать и даже получать их близкими к собственным разме­рам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации — молекулярный уровень. Иными словами, при использовании систем обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях, можно обшивать отдельные молекулы фермента полимерной оболочкой заданной толщины, т. е. в полном смысле одеть фер­мент в «рубашку, сшитую по мерке» (рис. 12,6).

Процесс ретикуляции может быть реализован не только в растворе фермента, но и при использовании его иммобилизован­ных препаратов. Так, в случае фермента, предварительно иммо­билизованного на химически инертном носителе путем физиче­ской адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом приведет к повышению прочности (задубливанню) препарата. Носитель здесь непосредственно не принимает участия в хими­ческой реакции — он служит лишь матрицей для организации

Однородном растворе

химическое

введение е' молекулу фермента скойои"

Рис, 12. Типы ретмкуляции ферментов:

а - межмолекулярная трехмерная (етка; б — сетчатая оболочка вокруг молекулы фермента (молекулярна иммобилизованный фермент); в- дв>мернзм сетка; г — внутримолекулярная сетка из полипептидных цепей белка и химических «скобок»

слоя (монослоя) адсорбированного фермента и обусловливает двумерную направленность ретикуляции. Более того, носитель может быть вообще удален (например, нитроцеллюлозу раство­ряют в метаноле) и, таким образом, получится сшитая фермент­ная пленка (рис. 12, з).

В принципе можно представить себе «нульмерную» ретикуля-

дню, поскольку являющаяся узлом ферментной сетки молекула фермента — это не условная точка, а довольно-таки крупный объект. Иными словами, от сеток межмолекулярых перейдем к внутримолекулярным, составленным нз полимерных цепей бел­ка и химических сшивок. Один из примеров такого рода был уже рассмотрен (рис. 12,6). Добавим, что препараты молеку-лярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы бнфункионального сшивающего реагента проезаимо-действуют с одной и той же молекулой белка. В таком случае (рис. 12, г) речь идет о наложении «химических скобок», внутри-молекулярно закрепляющих структуру фермента. Практическая реализация этого подхода в гомогенном растворе затруднена из-за образования наряду с внутримолекулярными межмолеку­лярных сшивок. Исключить меж молекулярные взаимодействия можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогениым сис­темам с пространственно изолированными молекулами фермента, например солюбилнэациеи ферментов в органических растворите­лях с помощью гндратированных обращенных мицелл ПАВ.