Грштгофщ (1-2)

НС—<СН,)*-5—CHi

кислоп (8 - 12}

чачяоп (8 - J2)

МрКН

J

НС—<CH_s)i—СООН

с

г

НС—СИ,—«ЮН

«=о

—он

с=о

I НС—СН(СН,)—ОН с—о

трео*пвд

г ВС—СН,- и

Гяупмин

NH

(5-8)

»исв, лейцв, ■эолсйшп,

оон

(40-5С)

Груши

Рис. 13. Полипептидная цепь. Условно составлена из аминокислот в порядке

убывания числа химических реакций, в которых способны принимать участие

функциональные группы нх Соковых ряднкалоп, в скобках при названиях амнио-

кисло* указано среднее процентное содержание в белках

тате этого за счет гидрофобных взаимодействий полипептидные цепи сворачиваются в глобулярные структуры, ядро которых и составляют неполярные фрагменты полипептидных цепей, а наружный слой образуют звенья с полярными и ионогенными группами, такими, как —SH, —ОН, —СООН, —NH₂. Конечно, некоторое количество гидрофобных группировок также может оказываться на поверхности; из л их на глобуле формируются контактные участки для связывания субстратов и {или) дли меж субъединичных взаимодействий. Ароматические аминокисло­тные остатки (тирозина' и триптофана) распределены между внутренними областями и наружным слоем так, чуо лишь часть из них оказывается доступной растворителю и, следовательно, растворенным в нем химическим реагентам.

Таким образом, с точки зрения возможностей иммобилизации ферментов белковые молекулы удобно предста­вить в виде своеобразных шариков с экспонированными наружу функциональными группами: тнольными (цистенна), гидроксиль-ными (алифатическими — ссрина и треонина» ароматическими — тирозина)_т карбоксильными (глутамнновон и аспарагнновой кис­лот» а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имида-зольными (гистидина) и аминогруппами (е-лизина н а-_т N- кон­цевыми). Оценку количества тех или иных групп в различных белках в первом приближении можно сделать по данным, при­веденным на рис. 13. Например, в таком небольшом белке, как трипсин или химотрипснн, с молекулярной массой около 25 000, должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических ОН-груип, 3—7 остатков тирозина, 7—12 остатков аргинина, свыше 10 аминогрупп и 40 карбоксильных групп. Результаты такой оценки соответствуют известным экспериментальным данным.

Но, конечно» нет правил без исключений- В природе встре­чаются белки, вообще не содержащие некоторых из приведен­ных на рис. 13 аминокислотных остатков, например цистеина. В пепсине, протеолнтическом ферменте с молекулярной массой около 35 000 имеются не два десятка, как этого можно было бы ожидать, а всего лишь две аминогруппы: одна в-лизин а и одна tf-концевая. Но недостаток одних групп на поверхности белко­вой молекулы компенсируется другими. В общем, количество функциональных групп в белках, доступных модифицирующим агентам, достаточно велико и, казалось бы, нет особых проблем для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с использо­ванием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы белка» которые не существенны для его функции (в нашем случае — катализа). С этой позиции попытаемся выявить в белке группы-мишени, наиболее предпочтительные для целей ковалент­ной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии. Во-первыл, группы-мишени должны быть высокиреакциейнеспо­собными» чтобы по возможности обеспечить избирательность реакции модификации, а также ее протекание в мягких недена-турирующих условиях. Во-вторых, таких групп в белке должно быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности для Введения новых химических связей в белковую молекулу с регуляцией их числа и локализации и снизить таким образом вероятность модификации активных центров ферментов. Данные о сравнительной реакционной способности и относительному содержанию аминокислотных остатков приведены на рис. 13..

Самыми реакционноспособными группами в белках являются SN-группы цнстенна. Они способны принимать участие в раз­нообразных химических реакциях: окисления, ацилировання, алкилирования и т. д. Однако собственные тиольные группы бел-

ка не очень подходят на роль мишеней для кова лент ной иммоби­лизации. Дело не только в том, что содержание цистеина в бел­ках в общем-то невелико. Очень часто в белках вообще нет сво^: бодных SH -групп: они участвуют в образовании дисульфидных мостиков, стабилизирующих структуру ферментов. В тех же слу­чаях, когда такие группы в белке есть, они, как правило, необхо­димы для каталитической активности. Тогда при иммобилизации возникает задача защитить SH-группы. Решить ее можно раз­личными приемами, например обработкой белка я-оксимерку-рибензоатом: после окончания иммобилизации защитная группа отщепляется в слабокислой среде. Несмотря на указанные осложняющие обстоятельства использование SH-групп для кова-леитной иммобилизации ферментов остается привлекательным и в ряде случаев может быть осуществимо. Разработаны также методы, позволяющие вводить в молекулу белка экзогенные SH-группы, например, модификацией аминогрупп белка подходя­щими реагентами, в частности а цитированием тиолактоном гомо-цистеина.

Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного рода химических модификаций и для целей ковалентной иммоби­лизации ферментов. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, их и белке достаточно много (см. рис. 13). Во-вторых, аминогруппы высокореакционнеспособны и уступают лишь SH-группам по числу и разнообразию реакций, в которых они могут принимать участие. В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второсте­пенную роль в поддержании структуры и функции ферментов. Важное свойство аминогрупп — способность прогонироваться (рК 9^—10), обеспечивает в физиологических условиях наличие на поверхности белков положительных зарядов, которые взаимодей­ствуют с противоионами из раствора или с отрицательно заря­женными карбоксильными группами белка, образуя в последнем случае солевые мостики. Если для нормального функционирования фермента важно сохранение положительного заряда, то этого можно достичь при химический модификации аминогрупп, пере­водя их (алкилированием) ил перыичиых во вторичные. В-четвиф-тых\ если некоторые аминогруппы, а не только их заряд, окажутся существенными для структуры а функции фермента, то их при необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием ангидридом три фтору ксусной кислоты или м алей новым ангид­ридом (первая из указанных защитных групп снимается в щелоч­ной среде, а вторая — в кислой). В-пятых, для ковалентной иммо­билизации ферментов посредством их аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и сшивающих реаген­тов.

Таким образом, наиболее удобной группой — мишенью, сле­дует считать аминогруппу. Однако, чтобы не сложилось впечат­ление об уникальности использования аминогрупп белков для целей ковалентной иммобилизации, необходимо отметить, что (как правило) обычные химические реагенты являются неспецифи

ческими и, помимо аминогрупп, в реакциях модификации могут принимать участие и другие функциональные группы белка, такие, как тиольные (цистеина), имидаэольные (гистидииа), гуаниднноаые (аргинина), гидроксильные (тирозина, серина и треонина), а также небелковые компоненты фермента или же реак­ционной системы, в частности вода. Реакционная способность тех или иных групп белка существенным образом зависит от условий: макро и микро. Группу макроусловий составляют такие, как природа растворителя» рН среды, температура —- эти условия могут и должны быть строго контролируемыми. Микроуслоикя, микросреда функциональной группы определяются структурой фермента, ее трудно изменять в нативиом белке, но важно учиты­вать при выборе метода и внешних условий модификации.

В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть, что в целом белковые структуры весьма лабильны и существует огром­ное количество факторов, в том числе химических, вызывающих денатурацию и инактивацию ферментов. Поэтому исключительную значимость при операциях с белками приобретает выбор реакции и условий ее проведения: желательно, чтобы эти условия были мягкими и неденатурируюшими. Что же касается получения, трансформации и химической активации носителей и сшивающих агентов, то здесь практически нет ограничений в выборе условий реакции. Без особого преувеличения можно сказать, что любой твердый материал (природный или синтетический) может быть использован при необходимости в качестве носителя ковалентно иммобилизованных ферментов (см. гл. I).