2015-09-06
1019
Общий анализ крови (ОАК) предоставляет клиницистам важнейшую информацию, так как характеризует физиологическое состояние организма, изменяющееся под воздействием различных внешних и внутренних факторов, и является неотъемлемой частью диагностического процесса и последующего мониторинга на фоне проводимой терапии.
С тех пор, как в 1895 году швейцарский врач Сали впервые предложил колориметрический метод определения концентрации гемоглобина в крови, прошло более 100 лет, однако до сих пор общий анализ крови не потерял значимости и актуальности. Развитие прикладных медицинских наук усовершенствовало подход к этому исследованию, но не изменило его сути. По-прежнему врачей интересует концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в единице объема крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и лейкоцитарная формула. Однако на смену рутинному подсчету клеток в счетной камере и визуальному определению гемоглобина в гемометре Сали пришли новые технологии, реализованные в гематологических анализаторах. Помимо общеизвестных показателей, использование анализаторов позволило пополнить ОАК новыми диагностически значимыми параметрами, которые расширили понимание процессов, происходящих в крови в норме и при той или иной патологии,стало реальным предоставлять значительно больше клинической информации о состоянии кроветворной системы и реагировании ее на различные внешние и внутренние факторы.
Материал для проведения общего клинического анализа крови.
Венозная кровь считается оптимальным материалом для клинического исследования. Это обусловлено тем, что при известной стандартизации процессов забора, хранения, транспортировки крови удается добиться минимальной травматизации и активации клеток, примеси других веществ (тканевой жидкости), при этом всегда имеется возможность повторить и/или расширить анализ.
Пункция кожи с целью получения капиллярной крови является процедурой выбора в тех ситуациях, когда получение венозной крови невозможно (у новорожденных, ожоговых больных, при выраженном ожирении, спавшихся венах). Однако следует помнить, что при прохождении капиллярной крови через поврежденную ткань активируются процессы свертывания крови, а с тканевой жидкостью в образец попадает большое количество тромбопластина, что влечет за собой образование в пробирке микросгустков.
Что касается нормальных значений основных показателей крови, то в литературе нет указаний на какие-либо достоверные различия в клеточном составе венозной и капиллярной крови, а также в концентрации гемоглобина и СОЭ.
Автоматизированное исследование клеток крови.
Высокотехнологические гематологические анализаторы способны измерять более 32 параметров крови, осуществлять полный дифференцированный подсчет лейкоцитов по 5-ти основным популяциям: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, что делает возможным в случае отсутствия от референсных значений этих показателей не проводить ручной подсчет лейкоцитарной формулы.
Аналитические возможности гематологических анализаторов:
· высокая производительность (до 100-120 проб в час)
· небольшой объем крови для анализа (12-150 мкл)
· анализ большого количества (десятки тысяч) клеток
· высокая точность и воспроизводимость
· оценка 18-30 и более параметров одновременно
· графическое представление результатов исследований в виде гистограмм, скатерограмм.
Гематологические анализаторы имеют систему обозначения - флаги или "сигналы тревоги" - указывающую на отклонение параметров от установленных границ. Они могут касаться как увеличения или уменьшения количества тех или иных клеток, так и изменения их функционального состояния, которое отражается на характеристиках измеряемых прибором клеток. Во всех этих случаях необходим строгий визуальный контроль окрашенных препаратов с соответствующими комментариями.
Диагностические возможности гематологических анализаторов:
· оценка состояния гемопоэза
· диагностика и дифференциальная диагностика анемий
· диагностика воспалительных заболеваний
· оценка эффективности проводимой терапии
· мониторинг за мобилизацией стволовых клеток из костного мозга.
Несмотря на все достоинства, даже самые современные гематологические анализаторы обладают некоторыми ограничениями, которые касаются точной морфологической оценки патологических клеток (например, при лейкозах), и не в состоянии полностью заменить световую микроскопию.
Автоматические счетчики крови оценивают размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. Они анализируют около 10000 клеток в одном образце и имеют несколько различных каналов подсчета клеточных популяций и концентрации гемоглобина. На основании количества определяемых параметров и степени сложности их можно условно разделить на 3 основных класса:
I класс - автоматические гематологические анализаторы, определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты.
II класс - высокотехнологичные гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, в том числе полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скатерограммы.
III класс - сложные аналитические системы, выполняющие не только развернутый анализ крови с дифференцировкой лейкоцитов по 5 параметрам, но и подсчет и анализ ретикулоцитов, некоторых субпопуляций лимфоцитов; при необходимости комплектуются блоком для автоматического приготовления и окраски мазков из заданных образцов крови.
В основе работы анализаторов I-го класса лежит кондуктометрический метод. Анализаторы II и III-го классов используют в своей работе комбинации разных методов.
Кондуктометрические гематологические анализаторы.
Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г. Wallace Н. и Joseph R. Coulter. Апертуро-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале возрастает. Несмотря на то, что изменение сопротивления невелико, современные электронные приборы легко его улавливают. Каждое событие - прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются.
Если в один и тот же момент в канале находятся две клетки, они регистрируются в виде одного импульса, что приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание этого, проба крови разводится до такой концентрации, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.
Апертуро-импедансный метод позволяет определять большинство эритроцитарных и тромбоцитарных показателей, связанных с объемом клеток (НСТ, MCV, МСН, МСНС, MPV), а также является основой для дифференцировки лейкоцитов по трем параметрам.
Высокотехнологические гематологические анализаторы.
Высокотехнологические гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти (5Diff) основным популяциям, используя различные принципы дифференцирования клеток: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, оценивать наличие незрелых гранулоцитов, анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, проводить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Многочисленные функции современных гематологических анализаторов стали возможны, благодаря развитию новых технологий, которые отличаются у разных фирм-производителей.
Определение гемоглобина.
Определение гемоглобина в крови является одним из основных методов лабораторного исследования. Одной из основных задач гемоглобина является перенос кислорода из легких в органы и ткани организма, что обеспечивает энергетические процессы в организме.
Норма содержания гемоглобина в крови варьируется в зависимости от возраста и пола:
• новорожденные - 210 г/л,
• дети 2-4 недель - 170,6 г/л,
• дети 1-3 месяца - 132,6 г/л,
• дети 4-6 месяцев - 129,2 г/л,
• дети 7-12 месяцев - 127,5 г/л,
• старше 2 лет - 116-135 г/л,
• мужчины - 132-164 г/л,
• женщины - 115-145 г/л.
В гематологических анализаторах к методам определения гемоглобина предъявляется ряд специфических требований. Во-первых, время реакции должно быть в десятки раз меньше для обеспечения высокой производительности анализаторов. Во-вторых, для оптимизации конструкции анализаторов гемоглобин должен измеряться в том же гемолизате, который используется для подсчета лейкоцитов, и, следовательно, компоненты, обеспечивающие гемоглобиновую реакцию, не должны негативно влиять на подсчет лейкоцитов.
Многие гематологические анализаторы измеряют концентрацию гемоглобина модифицированным гемиглобинцианидным методом. Высокая скорость реакции достигается путем быстрого лизиса эритроцитов, денатурирования и окисления гемоглобина до Fe+3 с помощью поверхностно-активных веществ. Последующая реакция с цианидом формирует устойчивую форму со спектром поглощения, похожим на спектр гемиглобинцианида в методе Драбкина, и максимумом поглощения около 545 нм. Достоинством метода является его простота, высокая скорость реакции и стабильность конечного продукта. Применение циановых методов в гематологических автоанализаторах имеет два существенных недостатка, связанных с тем, что цианид из флаконов постепенно выпаривается в виде синильной кислоты.Во-первых, это может оказывать вредное воздействие на персонал при плохой вентиляции помещения.Во-вторых, это приводит к ухудшению реакции и изменению калибровки по гемоглобину через 2-3 месяца после подсоединения к прибору флакона с гемолитиком.Учитывая недостатки модифицированных гемиглобинцианидных методов, в последние годы в большинстве новых моделей гематологических анализаторов используются бесциановые методы. Одной из первых бесциановый SLS (натрий лаурил сульфат)-метод использовала фирма Sysmex. Этот метод оказался не совместимым с определением лейкоцитов в одном канале, для его реализации используется дополнительный реагент и канал измерения.
В других современных бесциановых методах используются компоненты гемихромной реакции, которые совместимы с подсчетом лейкоцитов и их дифференциацией на три популяции. Высокая скорость реакции достигается путем быстрого лизиса эритроцитов, денатурирования и окисления гемоглобина до Fe+3 с помощью окислителей в присутствии поверхностно-активных веществ. При этом в качестве лигандов атомов железа гема используются отличные от цианида вещества.Оптимальной областью фотометрирования является максимум спектральной кривой поглощения. Для гемиглобинцианида - это 540 нм, которая и есть рабочая длина волны для этого метода. Измерение в максимуме кривой, где смягчаются требования к точности установки длины волны, снижает требования к точности изготовления и стабильности оптических фильтров. Максимум кривой поглощения гемихрома находится на длине волны 533 нм. Однако измерение на этой длине волны возможно только в спектрофотометрах. В фотометрических ячейках гематологических анализаторов, как правило, применяются полосовые светофильтры с типовыми длинами волн. Ближайшая к 533 нм типовая длина волны 540 нм, на которой и проводится фотометрирование с учетом коэффициента пересчета для 540 нм. При переходе с цианового на бесциановый метод, как правило, требуется корректировка калибровки гемоглобина в пределах 0-5%.
Качество результатов исследования крови на гематологическом анализаторе.
Качество результатов исследования крови на гематологическом анализаторе определяется следующими факторами:
- точностью дозирования цельной или разведенной крови;
- точностью дозирования изотонического раствора при проведении процедуры разведения крови;
- точностью определения объема суспензии, пропущенного через датчики подсчета клеток;
- точностью самого подсчета клеток;
- точностью определения размеров клеток;
- корректностью математических методов обработки первичных результатов измерений.
Во избежание случаев несовместимости реагентов следует использовать изотонический раствор и гемолитик от одного изготовителя. При смене реагентов одного производителя на реагенты другого производителя необходимо проверить калибровку анализатора по контрольной крови, обращая особое внимание на Hb и MCV/HCT, и при необходимости нужно делать перекалибровку этих показателей. Калибровка других показателей, как правило, не меняется.
При эксплуатации гематологических анализаторов важную роль играет качество электрической сети и заземления. Внезапное отключение электропитания приводит к сбоям в работе приборов и необходимости вмешательства инженеров сервисной службы. В том случае, если электрическое питание пропадает в момент забора пробы или анализа и появляется спустя несколько часов (5-20 ч), последствия могут оказаться значительно более серьезными - может выйти из строя гидравлика, засориться сгустками крови капиллярные трубки, апертура и т.д. Поэтому прибор должен работать с источником бесперебойного питания, который должен обеспечить возможность окончания анализа и промывку прибора, т.е. работу прибора в течение нескольких минут.
Периодически необходима калибровка по стандартным материалам, так как электронные и механические компоненты прибора, датчиков, насосов и т.д. со временем подвергаются старению и меняют свои технические параметры. Для осуществления калибровки необходимо пользоваться только качественными контрольными материалами!
Важно
Гематологические анализаторы очень чувствительны к длительным отключениям и перебоям в работе, что связано с подсыханием шлангов, проростом микрофлоры, кристаллизацией из растворов. При длительной остановке (на период отпуска, переезда или отсутствия реагентов) обязательным является заполнение шлангов консервирующими растворами с последующей многократной отмывкой от них.
Общее правило - не прерывать работу гематологического анализатора на длительный срок.
Показатели крови
В настоящее время большинство показателей выполняют на автоматических гематологических анализаторах, которые в состоянии одновременно определять от 5 до 24 параметров. Из них основными являются количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит, количество эритроцитов, средний объём эритроцита, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, среднее содержание гемоглобина в эритроците, полуширина распределения эритроцитов по размерам, количество тромбоцитов, средний объём тромбоцита.
WBC (white blood cells — белые кровяные тельца) — абсолютное содержание лейкоцитов (норма 4,5—9 10^9 кл/л) — форменных элементов крови — отвечающих за распознавание и обезвреживание чужеродных компонентов, иммунную защиту организма от вирусов и бактерий, устранение отмирающих клеток собственного организма.
RBC (red blood cells — красные кровяные тельца) — абсолютное содержание эритроцитов (норма 4,3—5,7 10^{12} кл/л) — форменных элементов крови — содержащих гемоглобин, транспортирующих кислород и углекислый газ.
HGB (Hb, hemoglobin) — концентрация гемоглобина в цельной крови (норма 132—173 г/л). Для анализа используют цианидный комплекс или бесциандидные реактивы (как замена токсичному цианиду). Измеряется в молях или граммах на литр или децилитр.
HCT (hematocrit) — гематокрит (норма 0,39—0,49), часть (% = л/л) от общего объёма крови, приходящаяся на форменные элементы крови. Кровь на 40—45 % состоит из форменных элементов (эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов) и на 60—65 % из плазмы. Гематокрит это соотношение объёма форменных элементов к плазме крови. Считается, что гематокрит отражает соотношение объёма эритроцитов к объёму плазмы крови, так как в основном эритроциты составляют объём форменных элементов крови.
PLT (platelets — кровяные пластинки) — абсолютное содержание тромбоцитов (норма 150—400 10^9 кл/л) — форменных элементов крови — участвующих в гемостазе.
Эритроцитарные индексы (MCV, MCH, MCHC):
MCV — средний объём эритроцита в кубических микрометрах (мкм) или фемтолитрах (фл)(норма 80—95 фл). В старых анализах указывали: микроцитоз, нормоцитоз, макроцитоз.
MCH — среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах (норма 27—31 пг), пропорциональное отношению «гемоглобин/количество эритроцитов». Цветной показатель крови в старых анализах. ЦП=MCH*0.03
MCHC — средняя концентрация гемоглобина в эритроците (норма 320—370 г/л), отражает степень насыщения эритроцита гемоглобином. Снижение MCHC наблюдается при заболеваниях с нарушением синтеза гемоглобина. Тем не менее, это наиболее стабильный гематологический показатель. Любая неточность, связанная с определением гемоглобина, гематокрита, MCV, приводит к увеличению MCHC, поэтому этот параметр используется как индикатор ошибки прибора или ошибки, допущенной при подготовке пробы к исследованию.
Тромбоцитарные индексы (MPV, PDW, PCT):
MPV (mean platelet volume) — ср. объем тромбоцитов (норма 7-10 фл).
PDW — относительная ширина распределения тромбоцитов по объёму, показатель гетерогенности тромбоцитов.
PCT (platelet crit) — тромбокрит (норма 0,108—0,282), доля (%) объёма цельной крови, занимаемая тромбоцитами.
Лейкоцитарные индексы:
LYM% (LY%) (lymphocyte) — относительное (%) содержание (норма 25—40%) лимфоцитов.
GR% — относительное (%) содержание (норма 47—72%) гранулоцитов.
Эритроцитарные индексы:
RDW — Red cell Distribution Width — «ширина распределения эритроцитов» так называемый «анизоцитоз эритроцитов» — показатель гетерогенности эритроцитов, рассчитывается как коэффициент вариации среднего объема эритроцитов.
RDW-SD — относительная ширина распределения эритроцитов по объёму, стандартное отклонение.
RDW-CV — относительная ширина распределения эритроцитов по объёму, коэффициент вариации.
P-LCR — коэффициент больших тромбоцитов.
Как правило, автоматические гематологические анализаторы строят также гистограммы для эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов.
