Стерилізація рослинного матеріалу

Поверхневі покриви усіх органів рослин звичайно забруднені спорами різних мікроорганізмів та грибів. Однак внутрішні тканини здорових рослин вважають стерильними, хоча і в них можуть знаходитись непатогенні бактерії. Особливо багаті на внутрішню інфекцію тканини тропічних і субтропічних рослин, які мають великі судини.

Основною умовою успішного отримання і вирощування калюсних і особливо суспензійних культур є стерилізація рослинних об’єктів, яка полягає у вбиванні грибних та бактеріальних спор на зовнішній поверхні без пошкодження внутрішніх тканин. Для цього використовують різні стерилізуючі речовини.

Вид стерилізуючої речовини, її концентрація і тривалість застосування залежать від густини і чутливості тканини, яка буде стерилізуватися. Правильний вибір стерилізуючої речовини полягає в тому, щоб вона згубно діяла на всі мікроорганізми і в той же час мінімально пошкоджувала тканини. Ще однією важливою умовою є те, що стерилізуюча речовина повинна легко видалятися із тканини промиванням дистильованою водою або розкладатися. Інакше відбувається отруєння тканин, що негативно впливає на утворення і ріст калюсу.

Звичайно, режим стерилізації встановлюють експериментально для кожного об’єкта. Проте існують загальні правила, яких варто дотримуватись.

Перед стерилізацією тканину очищають від залишків землі, засохлих листків, покривних лусок (бульби, коренеплоди, підземні пагони). Ретельно миють щіткою з милом у теплій проточній воді, потім промивають проточною водою (40–60 хв) і ополіскують дистилятом. Така попередня підготовка набагато зменшує контамінацію поверхневих тканин.

Листки, пагони трав’янистих рослин промивають теплою водою з милом, потім проточною водою (30 – 40 хв) і ополіскують дистилятом.

Як правило стерилізацію починають з занурення рослинного матеріалу в 70 % етанол: листки, бруньки на 10 – 20 секунд, насіння, бульби, корені – на 1 – 5 хв. Іноді достатньо поверхню пагонів, листків і великого насіння протерти ватою, змоченою спиртом (абсолютним).

Обробка тканин етанолом руйнує восковий наліт на листках, посилює дію (проникнення) стерилізуючих речовин.

Детергент додають для змочування поверхні: 65 – 70 % спирт діє як детергент і стерилізатор.

Найчастіше для поверхневої стерилізації рослинних тканин використовують сполуки, які містять активний хлор (гіпохлорит натрію, гіпохлорит кальцію, хлорамін), ртутні препарати (сулема, діацид) і окисники (перекис водню, перманганат калію), етиловий спирт, рідше – концентровану сірчану кислоту, препарати азотнокислого срібла та антибіотики. Ефективність стерилізації підвищується при додаванні на 1 л стерилізуючого агента 5-6 крапель Твін-80 або Твін-20.

Гіпохлорит натрію (NaClO) використовують для стерилізації насіння та рослиних тканин у концентрації 0,5 – 5 % впродовж 1 – 20 хв. Гіпохлорит натрію є клітинною отрутою. Тому після стерилізації NaClO рослинні тканини слід ретельно відмити стерильною дистильованою водою.

Гіпохлорит кальцію (Ca(ClO)₂) менш токсичний для тканин рослин ніж гіпохлорит натрію. Ca(ClO)₂ використовують для стерилізації бульб, пагонів, насіння, бруньок, зав’язей, квіток, плодів.

Для стерилізації менш забруднених об’єктів використовують розчин хлораміну у концентрації 0,2-6-10 % протягом 20-30 хв.

Розчини, які містять хлор, використовують одноразово відразу ж після приготування.

Стерилізуючі розчини, які містять ртуть використовують для стерилізації бульб, коренеплодів, насіння, пагонів деревних рослин. Найчастіше використовують 0,1 %-й розчин сулеми (HgCl₂).

Перекис водню використовують в основному для стерилізації насіння у концентрації 10-30 % впродовж 6-20 хв. Перекис водню найменше пошкоджує рослинні тканини і після нього не потрібне тривале відмивання, бо він швидко розкладається.

Концентровану сірчану кислоту використовують для стерилізації (5 хв) насіння з щільною оболонкою або опушеного. Обробка насіння кислотою, крім стерилізації, сприяє швидшому його проростанню в результаті покращення водо- і повітропроникності насінних оболонок.

Деякі рослинні тканини (бульби, цибулини) мають внутрішню інфекцію (зараження), якої складно позбутися звичайними методами стерилізації. У цьому разі використовують антибіотики – стрептоміцин, ампіцилін, ністатін, які звільняють матеріал від бактеріальної та грибкової інфекції, але погано впливають на проліферацію калюсу і регенерацію рослин, тобто послаблюють життєздатність експлантата.

Техніка стерилізації. Стерилізацію проводять у стерильних хімічних стаканах, накритих чашками Петрі. Очищений і промитий рослинний матеріал у боксі на декілька секунд або 1-2 хв поміщають у стакан з 70 % спиртом, потім стерильним пінцетом виймають і переносять у стерилізуючий розчин (табл. 3), після якого відмивають у 3-5 порціях стерильної дистильованої води.

Таблиця 3

Час стерилізації різних рослинних об’єктів

Орган рослини	Час стерилізації, хв
гіпохлорит натрію або кальцію	сулема
Насіння		10-20
Стебла деревних рослин	15-30	20-30
Стебла трав’янистих рослин	10-15	8-10
М’ясисті корені, бульби	20-25	15-20
Кореневища	20-30
Листкові пластинки	3-5
Верхівкові і пазушні бруньки	10-15	3-15
Тканини репродуктивних органів	3-5	1-5

Якщо об’єкти спливають, то їх накривають стерильним ватним тампоном для кращого контакту із стерилізуючим розчином. Дрібне насіння, плоди, бруньки стерилізують у мішечках із марлі або цупкої тканини.

Контрольні запитання і завдання

1. Які групи речовин входять до складу живильного середовища для вирощування in vitro клітин, тканин та органів рослин?

2. Назвіть основні живильні середовища, які використовують для культивування ізольованих клітин, тканин та органів рослин.

3. Які азотовмісні сполуки використовують як джерела азоту у живильних середовищах для культивування рослинних клітин, тканин та органів?

4. Чому до складу більшості середовищ залізо додають у хелатованій формі?

5. Як вік рослинної тканини, що культивується in vitro, впливає на склад живильного середовища?

6. Назвіть елементи обов’язкові складові живильного середовища.

7. Які елементи не обов’язково додавати до живильного середовища?

8. Які вуглеводи і у якій концентрації є найкращим джерелом вуглеводневого живлення для більшості рослинних тканин?

9. Назвіть основні суміші вітамінів, які додають до живильного середовища?

10. Які фітогормони використовують для росту і диференціації рослинних клітин?

11. На які групи розділяють рослинні тканини за потребою у фітогормонах?

12. Як впливає співвідношення ауксин:цитокінін на процеси органогенезу?

13. Чим обумовлене обмежене використання рослинних екстрактів як стимуляторів росту?

14. Які оптимальні межі рН для більшості рослинних культур?

15. Які типи культур особливо чутливі до значення рН?

16. У яких випадках до складу живильного середовища додається активоване вугілля?

17. Назвіть основні способи стерилізації живильних середовищ.

18. Назвіть відомі Вам речовини, які використовують для стерилізації рослинного матеріалу?

19. Які характеристики рослинного матеріалу необхідно враховувати вибираючи стерилізуючу речовину?

20. Які загальні правила стерилізації рослинного матеріалу?